负压渗透处理对花粉管加载荧光染料的影响

李 坤，王永章，屈海泳

(青岛农业大学 园艺学院，山东青岛 266109)

开花植物受精过程中，花粉在柱头萌发并伴随花粉管的生长将花粉管内部的精子注入雌蕊的胚中从而完成受精[1]。花粉萌发以及生长过程中都离不开Ca2+参与，关于Ca2+对花粉管生长重要性的研究自20世纪60年代就已经有报道，其不仅与花粉的萌发、花粉管的伸长紧密相关，而且还通过细胞内外复杂的信号网络参与花粉与柱头间的信号识别及受精过程[2-4]。有研究表明，体外培养3种相思花粉(Acaciaauriculiformis,Acaciamangium和Acaciacrassicarpa) 时，Ca2+的浓度过高或过低都会导致花粉管生长出现畸形，花粉管的正常生长需要Ca2+浓度维持在一个适当的范围[5]。在拟南芥的研究中发现，在花粉管尖端部位由Ca2+内流所形成的从尖端到基部的Ca2+浓度梯度是花粉管正常生长所必须[6]。同时，Ca2+会在花粉管尖端聚集，与质子及其他离子维持动态平衡，为花粉管正常的极化生长提供基础[7]。花粉管中形成的Ca2+浓度梯度不仅可以保证花粉管在花柱中极性生长并成功到达胚，同时还支配着尖端离子流动、囊泡运输以及细胞骨架的动态变化，确保花粉管尖端适度的极性生长来正确定位到雌蕊的胚，及时释放出精子细胞[8-9]。

植物细胞中游离的Ca2+及其结合的蛋白质是植物信号网络内重要的组成者和参与者，植物细胞质中Ca2+浓度易受环境刺激而发生变化，并影响细胞的发育和生长[10-11]。在植物受刺激的情况下，细胞质中的Ca2+浓度很容易发生短暂的变化，而且花粉管尖端伸长过程中，也需要胞外Ca2+内流维持尖端的Ca2+梯度，但目前关于Ca2+流动机制尚不甚清楚，需要探索一个稳定有效的监测方法来监测花粉管生长过程中Ca2+动态变化。因此探究一种可以用来准确反映植物细胞内Ca2+浓度变化的试验方法就显得尤为重要，这有助于进一步揭示Ca2+在细胞内的功能及其流动机制[12]。

Ca2+的荧光成像技术是用来研究细胞内Ca2+作用的一种比较直观有效的方法。目前植物细胞中的Ca2+荧光成像方法主要有两种：一种是以基因编码的绿色荧光蛋白为Ca2+指示剂成像方法，但此种方法需进行基因转化且耗时太长；另一种是使用具有荧光的有机小分子探针[8, 13-14]。常采用的小分子探针是Fluo-3、Fluo-4等，将这些小分子探针与乙酰甲酯结合易于透过动物细胞的细胞膜。但在植物细胞中，这些小分子探针易与活细胞细胞壁中含有的酯酶发生酶解作用而使探针不易透过细胞膜，因此有大量研究关于荧光试剂如何透过细胞膜，进入细胞内与钙结合产生荧光[15]。Ca2+荧光成像的效果很大程度上依赖于探针加载的方法，为促进这些小分子探针进入植物细胞，一种方法是通过显微注射的方法直接将探针注入细胞内，但这种方法对设备仪器和研究人员的熟练程度的要求比较高，不利于广泛使用。另一种常用的方法是低温加载法，可避免细胞中酯酶的酶解作用，但耗费时间偏长，一般需要过夜等[16-17]。目前用于检测花粉管细胞内Ca2+的探针或方法，在探针透过花粉细胞壁结合胞内Ca2+时大部分对花粉粒细胞结构造成伤害，使花粉活性降低[6, 12]。

目前有许多与负压渗透相关的报道，如通过负压辅助的方法促进基因载体渗透进入细胞，可以在无植物组织培养和再生的情况下获得基因转化株[18-19]。也有报道成功使用负压转化的方法进行不同种类植物的基因转化[20-22]。在负压条件下，细菌可以渗透进入到植物的部分器官进行转化，显著提高基因转化效率[23]。受此启发，本文探索在不影响花粉细胞结构和活性的情况下，采用负压渗透的方法改变加载的物理条件来促进荧光探针进入花粉细胞，检测花粉细胞内Ca2+浓度变化。

1 材料和方法

1.1 试验材料的收集及培养

本试验以丰水梨(PyruspyrifoliaNakai. cv. Hosui)的花粉为实验材料，在山东省果树研究所的试验果园收集，将开花前一天或当天即将开花的梨树花蕾取下，待花药自然散开后收集花粉，干燥后储存于-20 ℃条件下备用。花粉培养参考屈海泳等的方法[24]，花粉培养液中含有成分为1 mmol/L KNO3、0.55 mmol/L Ca(NO3)2、1.6 mmol/L H3BO3、1.6 mmol/L MgSO4和440 mmol/L蔗糖， pH值为6.0～6.2。

1.2 细胞内钙检测

Ca2+浓度检测采用荧光探针Fluo-4/AM(Dojindo Laboratories，日本)进行。Fluo-4/AM是Fluo-4的一种乙酰甲酯衍生物，Fluo-4/AM自身不具荧光，在适当的条件下培养可以穿透细胞膜，AM进入细胞后会被胞内酯酶水解，产生的Fluo-4具有足够敏感性，与Ca2+结合时荧光强度会增加100倍，可以用来监测报告细胞内游离的低浓度Ca2+[25]。

1.3 花粉管负压下加载荧光染料的方法

将50 μg的Fluo-4/AM溶解在91.2 μL的无水二甲基亚砜中，于-20 ℃条件下避光密封保存，得到Fluo-4/AM母液；将-20 ℃条件下密闭保存的花粉于常温放置2 h，与培养液混匀至最终浓度为1×105～1×107粒花粉/mL，于25 ℃条件下分别培养0.5 h和2 h，得到花粉粒悬浮液和花粉管悬浮液。

1.3.1花粉管负压加载荧光探针分别取2 μL的Fluo-4/AM母液和98 μL培养2 h的花粉管悬浮液放置于0.2 mL微量离心管中，混匀。然后将加入Fluo-4/AM母液和花粉悬浮液的离心管打开盖子分别置于4 ℃和25 ℃的真空干燥箱中，在负压条件下(-80 kPa)避光培养0.5～2 h，然后打开装置恢复到常压。对照为常压下不同温度的培养。将培养后的离心管进行离心，10 000 r·min-1离心1 min，弃去上清，用不含Fluo-4/AM的培养液洗涤3次。

1.3.2花粉粒负压加载荧光探针另取2只0.2 mL微量离心管加入98 μL培养0.5 h的花粉粒悬浮液，分别加入2 μL的Fluo-4/AM母液和2 μL花粉培养液，重复上述1.3.1的过程。对照加入100 μmol/L Fluo-4/AM在常压(4 ℃)条件下培养相同时间。

1.3.3显微镜观察使用激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5，德国)观察花粉管染色情况。检测时使用的激发波长为488 nm左右，发射波长为500～550 nm。

1.4 花粉萌发及花粉管活性的检测

在离心管中加入花粉和培养液后放置在负压(4 ℃)条件下处理2 h，之后放置于25 ℃的培养箱中培养2 h。对照不进行负压处理直接置于培养箱中培养2 h，在低倍镜下随机选取3个视野(重复)统计花粉萌发率，每个视野统计10个花粉。

使用红墨水进行染色，参考刘苇等的方法[26]，略有修改。具体操作：将负压条件下处理的花粉置于10% 的红墨水中，室温放置10 min，显微镜下进行观察统计。根据花粉细胞质膜的选择透过性和对探针选择吸收的能力来判断花粉的活性，丧失活性的花粉易被染色，而活力较强的正常花粉不能被染色。

1.5 Cd2+、La3+和EGTA对荧光的影响

Cd2+、La3+常被用作Ca2+通道抑制剂来观察植物细胞内Ca2+浓度变化[27]。在Fluo-4/AM加载完成后，分别在悬浮液中添加终浓度为10、100、1 000 μmol/L的 Cd2+和La3+，室温放置15 min进行观察。另外，在Fluo-4/AM加载完成的悬浮液中加入终浓度为10、100、1 000 μmol/L的Ca2+螯合剂EGTA(C14H24N2O10)，室温放置15 min进行观察。以正常培养负压加载Fluo-4/AM后的花粉作为对照。

1.6 图像分析

荧光图像使用软件Image-Pro Plus software和Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Mountain View, CA)进行分析处理，方法参考屈海泳等[24]。数据分析使用软件Microsoft Excel 2016。

2 结果与分析

2.1 负压渗透处理后对花粉活性及花粉粒加载Fluo-4/AM的影响

为验证负压是否会影响花粉萌发，将花粉悬浮液先在负压条件下培养2 h，发现花粉可以正常萌发(图1，A、B)，对花粉萌发率进行统计，结果负压条件下的萌发率为15.7%，与正常萌发的萌发率(对照)16.0%相比无显著差异(图1，E)。为验证负压是否会对已萌发的花粉管的活性产生影响，将负压条件下培养2 h的花粉使用红墨水进行染色发现，在负压条件下培养2 h的花粉管与没有负压培养的花粉管相同，都没有被染成红色(图1，C、D)，表明负压处理2 h对花粉的萌发及花粉管生长并无影响。

加入Fluo-4/AM之后的花粉悬浮液，在负压(4 ℃)条件下培养30 min，然后恢复常压。在激光共聚焦显微镜下进行观察发现，花粉粒在经负压处理后，含有Fluo-4/AM的悬浮液中有比较明亮的荧光(图2，A)，而常压处理和不含Fluo-4/AM的悬浮液中的花粉粒荧光非常微弱(图2，B、C)，这表明负压条件能促进探针Fluo-4/AM进入花粉粒。

A．对照，正常培养2 h的花粉生长状况；B．负压处理2 h后培养2 h的花粉生长状况；C．花粉正常培养2 h后，负压处理2 h后用红墨水染色；D．花粉正常培养2 h后，用红墨水染色,不进行负压处理；E．花粉萌发率(每组3次重复，每重复统计10个花粉，标尺=50 μm，P < 0.05)图1 负压渗透对花粉活性的影响A. Control, the pollens growing in normal culture for 2 h; B. The pollens were cultured for 2 h after vacuum infiltration treatment for 2 h; C. After cultured for 2 h, the pollens were stained with red ink after vacuum infiltration treatment for 2 h; D. After cultured for 2 h, the pollens were stained with red ink without vacuum infiltration treatment. E. Pollen germination rate (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen, bar=50 μm, P < 0.05)Fig.1 Effect of vacuum infiltration on pollen activity

2.2 花粉管负压渗透条件及渗透时间对Fluo-4/AM加载的影响

为研究花粉管加载Fluo-4/AM时，最适的负压渗透条件，将培养后的花粉进行了不同时间和不同条件下的加载处理。在加入Fluo-4/AM之前花粉管不含荧光(图3，A、B)；培养2 h的花粉加入Fluo-4/AM负压处理15 min后，花粉管尖端部分含有微弱荧光信号(图3，C、D)；在加入Fluo-4/AM负压处理30 min后，花粉管从基部到尖端出现比较明显的荧光信号和梯度变化，而且在尖端区域更加明显(图3，E、F)；在负压中处理1 h后，整个花粉管充满荧光，花粉管Ca2+梯度消失(图3，G、H)。表明在负压处理30 min后可以促进Fluo-4/AM进入花粉管中，若延长处理时间，则会导致花粉管Ca2+梯度消失。

A.加入Fluo-4/AM后负压渗透处理的花粉粒；B.没有添加Fluo-4/AM的花粉粒(对照)；C.添加Fluo-4/AM常压条件放置的花粉粒图2 负压渗透对花粉粒中Fluo-4/AM加载的影响A. After adding Fluo-4 /AM, the pollen grains were treated by vacuum infiltration; B. Control, the pollen grains without Fluo-4 /AM; C. Under the normal pressure condition after adding Fluo-4/AMFig.2 Effect of vacuum infiltration on Fluo-4 /AM loading in pollen grains

A和B.对照，没有添加Fluo-4/AM的花粉管；C和D.负压渗透处理15 min；E和F.负压渗透处理30 min；G和H.负压渗透处理1 h图3 负压渗透时间对花粉管中Fluo-4/AM加载的影响A and B. Control, pollen tube without Fluo-4 /AM; C and D. Vacuum infiltration treatment for 15 min; E and F. Vacuum infiltration treatment for 30 min; G and H. Vacuum infiltration treatment for 1 hFig.3 Effect of vacuum infiltration time on Fluo-4 /AM loading in the pollen tube

在正常培养2 h后的花粉管悬浮液中加入Fluo-4/AM，放置于常压和负压及4 ℃和25 ℃的条件下培养30 min发现，在室温(25 ℃)条件下，低压处理后可观察到部分荧光(图4，A、B)，而常压处理的花粉管中含有微弱的荧光(图4，C、D)，且主要分布在花粉管的边缘区域。另外，可以观察到在低温(4 ℃)条件下，经过低压处理的花粉管具有明亮的荧光，从尖端到基部的荧光密度存在由高到低的梯度变化(图4，E、F)，而常压条件下的花粉管虽然可观察到有荧光，但荧光较弱且无梯度变化(图4，G、H)。说明低压有助于探针透过花粉管质膜进入花粉管与Ca2+结合。低压情况下低温的荧光明显高于室温条件下，也表明低温对探针进入质膜同样有促进作用。

2.3 花粉管负压渗透处理加载Fluo-4/AM与F-127辅助加载比较

Pluronic F-127 (F-127)是一种较常用的可提高细胞渗透性的活性剂，常用来协助荧光探针进入细胞内[25]。取0.1 mL培养2 h的花粉悬浮液加入100 μmol/L Fluo-4/AM和0.2% F-127，在4 ℃条件下进行辅助加载2 h。与负压辅助加载相比，2种方法都能很好地反映花粉管中的Ca2+浓度梯度(图5，A～D)，加入F-127的花粉管尖端区域的荧光密度低于负压条件下加载的花粉管尖端的荧光密度，但差异不显著(图5，E)。说明负压条件下加载可以促进Fluo-4/AM进入细胞结合Ca2+，相较于使用F-127加载2 h，负压加载可以明显缩短加载时间。

2.4 La3+、Cd2+和EGTA处理后花粉管Ca2+梯度的变化

Cd2+和La3+处理可以抑制Ca2+离子通道。使用不同浓度的La3+对负压加载Fluo-4/AM的花粉管进行处理，发现在10 μmol/L的La3+处理时花粉管尖端Ca2+荧光密度显著降低，花粉管尖端的Ca2+梯度被破坏(图6，A～D、K)。另外，10 μmol/L的Cd2+处理时花粉管尖端到基部仍存在Ca2+浓度从高到低的梯度变化，但花粉管尖端所含的荧光密度明显降低(图6，A、B、E、F、L)，100 μmol/L、1 000 μmol/L的Cd2+处理后花粉管尖端的Ca2+梯度变化被破坏(图6，G、H、I、J)。

在使用10 μmol/L的Ca2+螯合剂EGTA处理时，对花粉管尖端的荧光密度并无显著变化，但对花粉管尖端Ca2+梯度产生影响，而100 μmol/L、1 000 μmol/L的EGTA处理时，花粉管尖端的荧光密度相较于10 μmol/L的EGTA处理出现了明显下降(图7)，说明细胞内Ca2+浓度降低，这可能是由于EGTA螯合胞外Ca2+，导致花粉管细胞外部Ca2+浓度降低，减少了Ca2+向细胞内的运输。

3 讨 论

花粉管的正常生长需要细胞内外Ca2+共同参与，胞内外Ca2+浓度变化对花粉管生长具有重要调节作用[28]。Ca2+荧光探针和Ca2+成像是研究细胞中Ca2+动态变化的重要方法，然而由于植物细胞细胞壁的存在使得大多数探针难以穿过活细胞的细胞壁，进入后又易在液泡聚集，不能准确地反映活细胞内Ca2+浓度的信息[29]。

目前植物细胞Ca2+成像最成功和广泛使用的技术是显微注射技术，将荧光探针直接微注射到植物细胞的细胞质中，但这种方法对操作者的技术要求较高，而且操作过程非常繁琐和耗时[30]。另外，使用显微注射技术对植物原生质体中的Ca2+加载时，由于原生质体失去了细胞壁和极性，它们的反应可能并不能准确反映其生理机制[31]。虽然目前存在许多荧光探针与具有细胞渗透性的乙酰甲酯结合可以透过细胞壁，结合激光共聚焦显微镜的使用可以检测不同刺激下植物细胞中Ca2+的空间分布变化，但是这种探针又必须在低温条件下进行，以此来避免细胞中酯酶对探针的酶解作用，因此导致这一类荧光探针加载时间较长，试验效率较低[24]。本研究中，负压渗透不影响花粉正常萌发生长，而且可以促进了荧光探针跨过花粉细胞壁进入花粉管，并没有破坏花粉细胞的结构和细胞活性，但随着负压渗透时间的延长可能会对花粉管存在伤害。有研究表明，在使用Fluo-4/AM加载细胞质中Ca2+时，随着加载时间的延长，Fluo-4/AM会受细胞内区室化的影响在细胞器内聚集，但这种情况可以通过低温条件下、缩短加载时间来避免[32]。本研究采用低温条件下负压渗透的方法，可以降低植物细胞壁中的酯酶对AM的酶解作用使Fluo-4/AM容易透过细胞壁加载到植物细胞中，避免荧光探针进入细胞时被水解及进入细胞后区室化的影响[33]。另外，在负压条件下，介质中各物质分子发生失重而四处飘游,增加了各分子间接触和碰撞的机会，使分子间的结合变得更加容易[34]。在此条件下荧光探针更容易和花粉管中的Ca2+结合使反应加速完成进一步提高染色的效率，但是需控制负压处理的时间，时间过长会对实验结果产生很大影响。

A和B.低压室温条件下处理30 min；C和D.常压室温条件下处理30 min；E和F.低压低温条件下处理30 min；G和H.低压室温条件下处理30 min图4 压强和温度对Fluo-4/AM加载的影响A and B. Under low pressure room temperature for 30 min; C and D. Normal pressure at room temperature for 30 min; E and F. Under low temperature and low pressure condition for 30 min; G and H. Under low pressure room temperature for 30 minFig.4 The effect of pressure and temperature on Fluo-4 /AM loading

A和B.负压渗透处理30 min；C和D.F-127处理2 h；E.负压渗透和F-127处理后花粉管尖端荧光值的统计分析 (每组3次重复，每重复统计10个花粉管，P < 0.05)图5 F-127处理对花粉管中Ca2+浓度的影响A and B. Vacuum infiltration treatment for 30 min; C and D. F-127 treatment for 2 h; E. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube after the vacuum infiltration and F-127 treatment (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P < 0.05)Fig.5 Effects of F-127 treatment on Ca2+ concentration in pollen tubes

A和B.对照，负压下加载染料的花粉管；C和D.10 μmol/L的La3+处理；E和F.10 μmol/L的Cd2+处理；G和H.100 μmol/L的Cd2+处理；I和J.1 000 μmol/L的Cd2+处理；K.不同浓度La3+处理后花粉管尖端荧光值的统计分析；L.不同浓度Cd2+处理后花粉管尖端荧光值的统计分析(每组3次重复，每重复统计10个花粉管，P < 0.05)图6 La3+、Cd2+对花粉管中Ca2+浓度的影响A. and B. Control, pollen tubes loaded with dye under vacuum; C and D. The pollen tubes were treated with 10 μmol/L La3+; E and F. The pollen tubes were treated with 10 μmol/L Cd2+; G and H. The pollen tubes were treated with 100 μmol/L Cd2+; I and J. The pollen tubes were treated with 1 000 μmol/L Cd2+; K. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration La3+ treatments; L. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration Cd2+ treatments (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P < 0.05)Fig.6 Influence of different concentrations of La3+ and Cd2+ on Ca2+ concentration in pollen tube

花粉管负压渗透加载Fluo-4/AM后不同浓度EGTA处理:A和B.对照，不含EGTA；C和D.10 μmol/L EGTA；E和F.100 μmol/L EGTA；G和H.1 000 μmol/L EGTA；I.不同浓度EGTA处理后花粉管尖端荧光值的统计分析(每组3次重复，每重复统计10个花粉管，P<0.05)图7 不同浓度EGTA对花粉管中Ca2+浓度的影响After vacuum infiltration loading Fluo-4 /AM, the pollen tubes were treated with different concentrations of EGTA: A and B. Control, without EGTA; C and D. 10 μmol/L EGTA; E and F. 100 μmol/L EGTA; G and H. 1 000 μmol/L EGTA; I. Statistical analysis of the tip fluorescence value of the pollen tube at different concentration EGTA treatments (Each group was repeated three times, and each repetition counted 10 pollen tubes, P<0.05)Fig.7 Influence of different concentrations of EGTA on Ca2+ concentration in pollen tube

虽然F-127常用来促进乙酸甲酯(AM)类Ca2+荧光探针进入细胞，在细胞内水解结合Ca2+[25]。但是在神经元细胞Ca2+的调控研究中发现，F-127显著地改变了神经元细去极化所诱发的Ca2+瞬变[35]。其次，由于F-127影响细胞质膜的透性，在平滑肌单细胞加载时使用F-127，会导致在细胞质中水解的探针释放出细胞，对实验结果造成干扰，所以F-127不适合用于单细胞中的Ca2+荧光成像[24, 36]。本研究结果表明，负压辅助加载效果与F-127辅助加载的效果并无明显差异，使用此种方法也可避免使用F-127所造成的不足。

Ca2+通道抑制剂La3+可以与Ca2+竞争抑制大量Ca2+通道，使细胞质中游离的Ca2+减少，另外其还可以抑制植物细胞质膜上Ca2+渗透通道来抑制Ca2+流入[37]。在La3+的影响下，花粉管生长、Ca2+通道渗透性、细胞内Ca2+梯度和细胞外Ca2+浓度都会受到显著影响[38]。因此，La3+常用来影响花粉萌发和花粉管正常生长。在La3+离子存在的情况下，花粉管的荧光密度和Ca2+浓度梯度都发生了显著变化。其次，有研究认为高浓度的Cd2+会抑制花粉萌发和花粉管的生长[39]。Cd2+的存在减少了细胞壁可塑性和可扩展性，并损害花粉管正常的细胞伸长，导致形态和结构的改变。同时，Cd2+的存在抑制了花粉管尖端Ca2+的流入，导致尖端Ca2+梯度紊乱、花粉管荧光强度降低，这与文中Cd2+的处理结果相一致[24, 40-41]。另外，花粉生长时，细胞外Ca2+流入细胞内可以促进细胞质游离Ca2+浓度增加，维持花粉管极性生长所需的浓度梯度[42]。在EGTA处理后，EGTA可以螯合花粉管外部Ca2+，影响花粉管的正常生长，这种细胞外Ca2+在花粉管生长中的作用机制目前仍不清楚，但对细胞壁结构稳定性、膜完整性，以及对细胞内信号网络的影响都是有可能的[43-44]。使用抑制剂及螯合剂改变花粉管内外Ca2+的浓度，花粉管中荧光密度都出现了相应的变化，也表明此方法具有一定可靠性。

总之，此处理方法不仅具有所需器材也较容易准备和使用方法易于掌握等优点，而且在低温负压条件下加载可以保持花粉活力，促进荧光探针通过质膜渗透进入花粉管，有效缩短探针加载时间从而避免细胞内区室化的影响。