臭氧和干旱对梓树叶片色素含量和荧光生理的影响

陶汉成 马长乐 徐 胜

(1.西南林业大学国家林业局西南风景园林工程技术研究中心，云南 昆明 650224；2.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016；3.中国科学院森林生态与管理重点试验室，辽宁 沈阳 110016)

近地面臭氧是一种具有强氧化性的污染物，过高的浓度会对植物造成毒害作用[1]。近年来，随着工业化和城市化的快速发展，大量臭氧前体物如氮氧化物和挥发性有机物排放到大气，地表臭氧浓度不断上升，世界各国的城市臭氧污染问题愈发严重[2]。据报告，2015—2050年全球平均臭氧浓度将增加 20%～25%，至2100年北半球平均臭氧浓度将超过75 nmol/mol[3]，已经超过了臭氧对植物造成伤害的临界浓度。同时，由于我国大部分地区处于季风气候影响区，干旱情况频繁发生[4]，干旱化趋势是我国大部分地区正在面临的问题。夏季是植物生长最旺盛的时候，高温下地表水分流失加快、增加了短期干旱发生的频率，而高温、强光也使得臭氧前体物转化为臭氧的速率加快，地表臭氧浓度急剧上升，臭氧浓度升高和干旱经常同时发生，共同对植物生长造成威胁。另外，由于城市气候具有气温高、风速小和湿度低等特点，这使得臭氧和干旱对城市树木的伤害作用更加明显[5]。

当植物受到臭氧或干旱胁迫时，会对植物光合作用产生显著影响。臭氧通过开放的气孔进入叶片内部，破坏植物光合系统，抑制光合系统II (PSII) 反应中心活性，降低光能利用效率，阻碍光合电子传递[6]；对细胞膜脂造成氧化损伤，破坏叶绿体结构，阻碍光合色素合成[7]。干旱则会降低植物细胞含水量，诱导气孔关闭，减少CO2吸收，抑制植物对光能的吸收和转换能力[8]；使得细胞内产生大量活性氧自由基，对细胞膜脂以及生物大分子造成伤害，降低叶绿素含量[9]。而臭氧和干旱复合胁迫对植物有加剧伤害的协同作用和减轻伤害的拮抗作用，国外内研究结果并不统一，这主要取决于植物对臭氧和干旱的敏感性、臭氧和干旱的发生顺序和强度以及植物生育阶段差异等[10]。

梓树 (Catalpaovata) 是紫葳科梓属乔木，因其树姿优美、适应性强、生长快速、抗污染能力强等特点在我国东北、华北及西部地区广泛种植，是集优质用材、园林观赏、生态防护和药用等多功能于一体的绿化树种[11]。前人已研究了臭氧和干旱单因子胁迫对梓树光合特征的影响[12-13]，但是尚未研究二者复合胁迫下其光合色素和荧光特征的变化。本研究选择1年生梓树幼苗为研究对象，利用开顶式气室 (OTCs) 进行臭氧熏蒸和干旱试验，研究臭氧和干旱以及复合处理对梓树叶片的光合色素含量和叶绿素荧光的影响，探讨臭氧和干旱复合胁迫下梓树光合作用的响应机制，以期为筛选适应臭氧污染和干旱的城市绿化树种提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地点位于中国科学院沈阳应用生态研究所树木园 (41°46′ N，123°26′ E)。本试验采用开顶箱 (OTCs) 熏蒸法，试验主要设施为开顶箱，及与其配套的通气、通风设备。OTCs为钢架结构搭建的底面正八边形的直径400 cm，高为300 cm的玻璃气室，气室上部为向内倾斜45°斜面，气室之间的距离为400 cm，避免气室之间相互遮光，其相关的配套设备主要包括：臭氧发生器XH-2000 (广州鑫弘智能环保设备有限公司，中国)、固定式气体检测仪Series-900 (Aeroqual Inc.，新西兰)、臭氧浓度自动控制器 (Campbell Scientific Inc.，美国)、电信数据信息传输监测与远程调控系统 (北京华益瑞科技有限公司，中国)。

试验材料为1年生梓树幼苗，于2017年5月移栽于下口径20 cm、高25 cm塑料花盆中，每盆1株，培养基质为V(园土)∶V(草炭)=2∶1的混合基质，所有试验苗栽培管理方法一致。于熏蒸前30 d挑选健康状况良好、长势一致的幼苗移入OTCs内，在OTCs内苗木位置随机分布。

1.2 试验设计

根据参考文献 [10]，本试验设置了自然浓度臭氧 (E40，约40 nmol/mol) 和高浓度臭氧 (E120，约120 nmol/mol) 2个臭氧处理，正常灌溉 (NI，约75% ± 5%饱和田间持水量)、轻度干旱胁迫 (MD，约60% ± 5%饱和田间持水量)、重度干旱胁迫 (SD，约45% ± 5%饱和田间持水量) 3个水分处理。具体试验处理组见表1。

表1 试验设置Table 1 Setting of treatment groups

试验于2017年月8月20日—10月5日通气，每日10 h (8:00—18:00) 通入120 nmol/mol臭氧，阴雨天气停止通气 (在通气前1周控制水量达到处理设置要求)。用土壤水分测定仪定时测定土壤水分含量，通过浇水来控制水分含量 (已测得实际土壤饱和含水量约为32%)。雨天在开顶箱用高2 m的钢管为支架，聚乙烯薄膜覆盖，搭建简易遮雨棚，晴天不遮挡。在第15天和第30天测定叶片荧光参数，并采集叶片样本测定生理指标。

1.3 试验方法

1.3.1叶绿素荧光参数测定

采用FMS2脉冲调制式荧光仪 (Handstech,英国) 测定叶绿素荧光参数。具体测定方法：在晴朗天气的上午9:00—11:30，选择位于植株冠层中部的成熟叶片，先将叶片暗反应20 min，照射检测光获取初始荧光(F0)，随后照射饱和脉冲光(白光)得到最大荧光(Fm)、PSII电子传递量子产率 (ΦPSII) 和PSII最大光化学效率 (Fv/Fm)。荧光测定结束后，将该植物叶片剪下并低温保存，迅速转移到试验室用于其他指标的测定分析。

1.3.2光合色素含量测定

采用95%乙醇提取，用分光光度比色法测定并计算出叶片总叶绿素 (Chl(a + b)) 含量、叶绿素a/b (Chl a/b) 以及类胡萝卜素 (Car) 含量[14]。

1.3.3含水量和相对含水量测定

采用称重法测定叶片水分含量。选择在晴朗天气的上午，采集植物中部健康成熟的叶片，用电子天平 (精确至0.001 g) 快速称得叶片鲜质量；将样品浸入水中2小时取出，用吸水纸擦干样品表面水分，称得叶片饱和鲜质量；放入烘箱于105 ℃杀青，然后于80 ℃烘干至恒温，称得叶片干质量。按公式 (1)～(2) 计算叶片含水量和叶片相对含水量[15]。

叶片含水量=(叶片鲜质量-叶片干质量)/叶片鲜质量

(1)

叶片相对含水量=(叶片饱和鲜质量-叶片鲜质量)/(叶片饱和鲜质量-叶片干质量)

(2)

1.4 数据分析

数据采用Microsoft Excel 2017和SPSS 16.0软件统计分析，以臭氧和干旱分别作为影响因子对各指标的作用以及交互作用进行方差分析。所有数据在处理前均进行了方差齐性和正态分布检验。处理组间采用Duncan多重比较法检验。

2 结果与分析

2.1 臭氧和干旱对梓树叶片含水量和相对含水量的影响

臭氧、干旱、处理时间及共同作用对各因素方差分析结果见表2。

表2 臭氧、干旱、处理时间及共同作用对各因素方差分析结果Table 2 ANOVA analysis of ozone,drought,treatment time and their interaction on the all variables

注：*表示差异显著 (P< 0.05)，**和***表示差异极显著 (P< 0.01)。

由图1可知，梓树叶片含水量在臭氧、干旱和复合处理下均有所下降。干旱处理降低了梓树叶片相对含水量，在30 d时MD和SD较CK降低10%和10.97% (P< 0.05)。臭氧处理下叶片相对含水量随着时间延长逐步下降，并且在30 d时较CK显著降低了4.04% (P< 0.05)。复合处理下，EO + MD和EO + SD在30 d较CK显著降低了8.37%和12.49% (P< 0.05)，但是较同等单因子处理组无显著差异。

不同小写字母表示差异显著 (P< 0.05)。

图1臭氧浓度升高和干旱对梓树叶片含水量和相对含水量的影响
Fig.1 Effects of elevated ozone and drought on water content and relative water content ofC.ovataleaves

2.2 臭氧和干旱对梓树叶片光合色素含量的影响

如图2所示，在臭氧和干旱单因子处理下，梓树叶片Chl (a + b) 和Car含量均表现出先升后降的趋势，在15 d时较CK显著上升 (P< 0.05)，在30 d时较CK有所下降，臭氧和干旱单因子处理对Chl a/b没有影响。复合处理下，梓树叶片Chl (a + b) 和Car含量随着时间延长和干旱强度增加逐步下降，EO + MD介于同等单因子处理组之间，EO + SD显著低于同等单因子处理组 (P< 0.05)；Chl a/b随着时间逐步下降，30 d时EO + SD较CK显著降低了13.6% (P< 0.05)。

2.3 臭氧和干旱对梓树叶片叶绿素荧光参数的影响

由图3可知，在臭氧处理下，梓树叶片ΦPSII先升后降。干旱处理下，MD使得梓树叶片ΦPSII有所增加，SD使得梓树叶片ΦPSII有所下降，并在30 d时MD显著高于SD处理 (P< 0.05)。复合处理下梓树叶片ΦPSII低于CK，但不显著。同时，梓树Fv/Fm先升后降，在15 d时较CK显著增加了14.54% (P< 0.05)，在30 d较CK降低了7.1%。在干旱处理下，MD使得Fv/Fm有所增加，SD使得Fv/Fm先升后降。在复合处理下，EO + MD较CK有所上升；而EO + SD较CK先升后降，在15 d时较CK增加了16.92%，在30 d时显著降低了13.62% (P< 0.05)。

不同小写字母表示差异显著 (P< 0.05)。

图2臭氧浓度升高和干旱对梓树叶片Chl(a+b)、Chla/b和Car含量的影响
Fig.2 Effects of elevated ozone and drought on chlorophyll content,Chl a/b and carotenoid content ofC.ovataleaves

不同小写字母表示差异显著 (P< 0.05)。

图3臭氧浓度升高和干旱对梓树叶片Fv/Fm和ΦPSII的影响
Fig.3 Effects of elevated ozone and drought onFv/Fmand ΦPSII ofC.ovataleaves

3 结论与讨论

叶片含水量能够衡量叶片内水分含量的高低，并不能用来判断植物的抗旱能力，但是可以用作参考土壤含水量的变化[16]。而叶片相对含水量是指植物组织实际含水量占水分饱和时的含水量，它能够反映植物体代谢活动的程度，一般来说，相对含水量越高，植物的抗旱性就越好[17]。本试验中，干旱显著降低了梓树的叶片含水量，但是臭氧对叶片含水量没有影响，这说明梓树对于水分胁迫较为敏感，能够调整水分代谢来适应干旱环境。而梓树的叶片相对含水量在臭氧和干旱胁迫下降低，但是在复合胁迫下，梓树的相对含水量变化趋势与干旱单因子相似，干旱是影响梓树叶片含水量的主要因素，臭氧对于梓树叶片相对含水量的影响远小于干旱。

Chl和Car是重要的光合色素，在光合系统中起着能量传递的作用，其含量变化直接影响到植物光合作用强度。有研究表明，臭氧和干旱胁迫对Chl和Car具有破坏作用。山杜英 (Elaeocarpussylvestris) 幼苗叶在臭氧处理下Chl含量显著下降，并且随着臭氧浓度的升高，下降幅度加大[18]；干旱显著降低了元宝枫 (Acerturncatum) 早生叶片的Chl含量[19]。在本试验中，梓树Chl (a + b)含量在臭氧和干旱处理下先升后降，说明梓树对于短期臭氧熏蒸和干旱具有一定适应性，但是长时间的胁迫仍然有伤害作用。而复合处理下梓树叶片Chl(a + b) 含量和Chl a/b介于臭氧和干旱处理之间，说明干旱保护和减缓了臭氧对Chl和Car含量的下降。一个原因可能是干旱诱导气孔闭合，降低了植物吸收的臭氧的剂量，起到了保护作用[19]；另一个原因可能是干旱使得叶片含水量降低，提高了叶片单位质量下的色素含量。而臭氧和重度干旱交互作用下叶片Chl a/b显著降低，说明复合胁迫产生交互协同作用，双重伤害导致叶片活性氧含量大量增加，使得分布在基质类囊体膜上或者基粒类囊体的边缘上的Chl a更优先被氧化[20]。梓树对于干旱有一定耐受性，能够调节色素含量来应对干旱环境，缓解臭氧对于色素的分解作用，但是严重干旱胁迫会显著降低其光合色素含量。

植物在进行光合作用时，叶绿体将吸收光能传递、转换为电能的过程中，有一部分光能损耗是以较长的荧光方式释放[21]。叶绿素荧光参数即是用来描述在这个过程中光能损失的数据，其变化趋势可以在一定程度上反映逆境对植物光合作用系统产生的影响。Fv/Fm是PSII反应中心内禀光能转换效率，在非胁迫环境条件下变化极小，但在逆境胁迫条件下，该参数会明显下降；ΦPSII是PSII反应实际光量子效率，它代表了植物所能够利用光能效率。有研究表明，红砂幼苗在干旱条件的Fv/Fm和ΦPSII呈明显降低趋势[22]；小麦 (Triticumaestivum) 在臭氧熏蒸条件下2组参数也都显著降低[23]，这说明干旱和臭氧都能对植物光合PSII反应阶段造成损伤，降低光合作用能力。在本试验中，梓树叶片ΦPSII和Fv/Fm和单独臭氧处理下先升后降，但较CK无显著差异，梓树对于120 nmol/mol的臭氧浓度具有一定的适应性，逆境环境没有损害PSII光合器官。但熊冬兰等[12]研究发现在浓度为160 nmol/mol的臭氧熏蒸20 d后梓树叶片ΦPSII和Fv/Fm会显著下降，说明过高臭氧浓度会严重抑制梓树的光合作用，破坏植物光合器官。另外，短期的干旱对于梓树光合作用具有促进作用，提高了其叶片ΦPSII和Fv/Fm，原因可能是干旱条件下梓树幼苗会将更多的资源集中到根系生长中，提高竞争能力，促进了光合作用[24]，但是长时间的重度干旱抑制了植物生长，降低了梓树叶片ΦPSII和Fv/Fm[25]。高浓度臭氧和重度干旱复合处理使得梓树叶片ΦPSII和Fv/Fm显著低于CK，交互处理造成协同伤害，降低了植物的光合作用能力；高浓度臭氧和轻度干旱处理下叶片ΦPSII和Fv/Fm较CK无显著降低，梓树PSII活性中心没有受损，梓树发生的光抑制不明显。梓树对于干旱和臭氧都有一定的抗性，适度的干旱可以提高梓树的光合作用，但是重度干旱和臭氧胁迫对于梓树具有显著的协同抑制作用。