油茶转录组测序与SSR特征分析

张 震 许彦明 陈永忠 李志钢 王湘南 陈隆升 彭邵锋 马 力 王 瑞 李美群 唐 炜 彭映赫

(湖南省林业科学院，国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

油茶 (Camelliaoleifera) 是我国特有的木本油料树种，主要分布在长江以南各省份，因为其独特的食用价值和保健价值，备受人们青睐。它与油棕 (Elaeisguineensis)、油橄榄 (Oleaeuropaea) 和椰子 (Cocosnucifera) 并称为世界四大木本油料树种，被誉为 “东方橄榄油”。我国油茶育种工作始于20世纪60年代中后期，陆续选育出众多的农家良种、优良家系和优良无性系，为提高油茶产量，促进油茶产业发展奠定了坚实的基础[1]。目前我国茶油年产量仅有50万t，难以满足国内市场的需求。因此，基于现代生物技术开展油茶分子育种、种质资源多样性、遗传性研究，对培育高产、高含油率的品种具有重要意义[1]。简单重复序列标记 (Simple Sequence Repeat,SSR) 具有共显性、效率高、成本低、灵活性强等优点，被广泛应用于分子育种、遗传多样性、种质资源进化及亲缘关系等多项研究。

传统的SSR分子标记开发技术主要有AFLP、RAPD、SRAP、ISSR等，基于这些技术，油茶科技工作者已经开展了相关的研究工作，包括引物筛选、扩增，油茶亲缘关系、遗传多样性研究等内容，并取得了一定的成果[2-9]。然而，利用传统方法开发SSR分子标记往往存在效率低，周期长，且成本高等问题。转录组测序技术不仅能够获得丰富的转录组数据，而且具有低成本、时间短等优势，能够很好的解决这些难题[10]。目前一些物种已经利用转录组测序技术进行SSR分子标记的开发[11-14]，油茶方面也开展了相应的研究。Jia等利用高通量测序技术开发出15对多态性较好的SSR引物，用于分析不同油茶品种间的遗传聚类、亲缘关系[15]；李海波等利用Illumina测序技术筛选出20对扩增效率高、稳定性好的多态性SSR引物对56个 “长林”、“龙林” 系列的油茶品种进行聚类分析[16]；史洁利用Roche 454测序技术对浙江红花油茶进行测序，共获得11 344个SSR，并对SSR的基本特征、多态性、可用性进行研究[17]；温强等利用Roche 454测序技术筛选出18对SSR引物对浙江红花油茶进行遗传多样性研究[18-19]。目前基于转录组测序技术开发的普通油茶SSR引物数量还十分有限，难以满足油茶遗传多样性、分子育种等研究的需求。因此，本研究对普通油茶转录组Unigene中的SSR位点的数量、频率、基序类型，基序长度等特征进行分析，以期能够为油茶分子标记开发、分子辅助育种、遗传多样性、遗传资源鉴定、保护等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 转录组数据来源

实验材料来自湖南省长沙市天际岭试验林场，选择生长健壮、无病虫害的优良单株进行采样，将采集好的油茶叶片用清水洗净后迅速投入-80 ℃液氮速冻。样品送至昆明云初生物科技有限公司，mRNA分离、纯化后进行cDNA文库构建，利用Illumina HiSeqTM 2000双端测序仪进行上机测序。双端测序将每个cDNA片段分别从5′ 端和3′ 端进行测序，从而在测序后得到两端的reads序列，每个read序列长约为150 bp，共获得5 877 182 226个raw reads。利用perl script去除raw reads中含有接头的、无法确定碱基比例大于5%及一些质量值Q ≤ 20的碱基数占整个序列的50%以上的低质量序列，共获得575 534 790个干净序列 (clean reads)。通过Trinity软件对Clean reads进行De Novo组装[20]:1) 利用Trinity软件对包含overlap的序列片段进行处理，将其连接成比自身更长的序列片段，然后通过组装，获得不含未知核酸序列的片段，即Contig。2) 将reads再次比对回Contig，通过paired-end reads确定来自同一转录本的不同Contig及这些Contig之间的距离，利用Trinity软件将这些Contig连在一起，得到两端不能再延长的序列，即Unigene。3) 通过TGICL序列聚类软件对这些Unigene进行进一步序列拼接和去冗余处理，得到不含N的序列，共获得311 283条非冗余Unigene序列。

1.2 实验方法

1.2.1转录组SSR位点搜索

使用MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/Misa.html) 对转录组Unigene序列进行搜索。搜索条件为：单核苷酸 (mononucleotide)、二核苷酸 (dinucleotide)、三核苷酸 (trinucleotide)、四核苷酸 (tetranucleotide)、五核苷酸 (pentanucleotide)、六核苷酸 (hexanucleotide) 的最小重复次数分别设置为10、6、5、5、5、5。

1.2.2统计方法

利用Excel软件进行数据统计与分析。发生频率计算方式为含SSR的Unigene数量/总Unigene数量，出现频率计算方式为SSR数量/总Unigene数量，平均距离是指每个SSR位点之间相隔的距离，计算方式为总序列长度/SSR数量。

2 结果与分析

2.1 油茶转录组中SSR位点的频率和分布密度

油茶转录组测序共获得575 534 790条干净序列，利用TGICL聚类软件进行De Novo组装，经过序列拼接和去冗余处理，共获得311 283条Unigene序列，总长度约为1.5 × 108bp，GC含量为39.17%，平均长度为497.67 bp，具体组装信息详见表1。

基于MISA搜索标准，在311 283条Unigene序列中共发现包含1～6重复基元的SSR位点104 515个，分布在80 724条Unigene中，发生频率 (含SSR的Unigene数量与总Unigene数量的比值) 为25.93%。其中，其中，61 807条Unigene含有单个SSR位点，18 917条Unigene含有2个以及2个以上SSR位点，8 008条Unigene含有复合型SSR位点。油茶转录组中SSR位点的出现频率 (SSR数量与总Unigene的数量的比值) 为33.58% (表2)。油茶转录组SSR位点平均距离为1.48 kb。

基于Weber的分类标准，SSR主要包括精密型 (perfect repeat sequences)、非精密型 (imperfect repeat sequences) 和复合型 (compound repeat sequences) 3种类型[21]。104 515个SSR位点中有96 507个 (92.34%) 精密型SSRs，700个 (0.67%) 非精密型SSRs和7 308个 (6.99%) 复合型SSRs。在精密型SSRs中，单核苷酸和二核苷酸是主要的重复类型，共占SSR总数的80.41%，其中，单核苷酸重复所占的比例最大，为48.48%，二核苷酸重复次之，为31.93%，四、五、六核苷酸重复的数量较少，总计2.60%。从长度看，核苷酸重复类型平均长度为18.66 bp。单核、二核、三核、四核、五核、六核苷酸重复平均长度分别为14.16、19.33、19.16、21.72、26.16、36.51 bp，具有一定的差异性。从SSR分布密度看，不同核苷酸重复类型的平均分布距离具有显著差异，总体上呈现出随出现频率的增加而缩短的趋势 (表3)。

表2 油茶转录组中SSR搜索结果Table 2 Searching results of SSR in transcriptome of C.oleifera

表3 油茶转录组中SSR的数量、频率和平均距离Table 3 The number,frequency and average distance of SSR in transcriptome of C.oleifera

2.2 油茶转录组中精密型SSR基元类型和比例

油茶转录组精密型SSRs中 (合计96 507个)共发现812种基元类型，单核、二核、三核、四核、五核、六核苷酸重复分别有4、12、60、135、207、394种 (表4)。单核甘酸中A重复数量最多，为25 014个 (25.92%)，其次是T重复，24 394个 (25.28%)。二核苷酸中主要的重复基元是AG (6 379个，占6.61%)、GA (5 741个，占5.95%)。三、四、五、六核苷酸中最多的重复基元分别是AAT (615个，占0.64%)、AAAT (319个，占0.33%)、TTTTC (25个，占0.03%)、TTTTTG (8个，占0.01%)。

表4 油茶转录组SSR重复基元序列特征Table 4 Sequence features of SSR motifs in transcriptome of C.oleifera

从核苷酸重复基序类型来看，单核甘酸中的A/T重复基序为主要的类型 (49 408个，占51.20%)。二核苷酸中AG/CT为主要类型，共11 112个，占总SSR的11.51%，其次是AT/TA重复基序 (8 613个，占8.92%) 和AC/GT重复基序 (1 204个，占1.25%)。三核苷酸中AAT/ATT (989个，占1.02%) 出现频率最高，其次是ACC/GGT (505个，0.52%) 和ATC/ATG (260个，0.27%)。四核甘酸中AAAT/ATTT占绝对优势，其次是AAAG/CTTT。五核甘酸中以AAAAT/ATTTT为主 (图1)。

2.3 油茶转录组中SSR重复次数和基序长度

作为评价其可用性的重要依据，SSR多态性通常受到基元重复次数和基序长度的影响[22]。从单次重复次数来看，油茶转录组中精密型SSRs (合计96 507个) 重复单元的重复次数主要集中在10次以上。其中，比例最高的是10次重复 (共15 751个SSR，占16.32%)，其次是11次重复 (共10 901个，占11.30%) 和6次重复 (共10 811个SSR，占11.20%)。总体上，除单核甘酸外，其他核苷酸重复次数主要集中5～10低次重复。从核苷酸类型看，单核甘酸中出现频率最高的重复次数为10次，为13 315个。二核苷酸中6次重复的SSR数目最多，为8 070个。三核、四核、五核和六核苷酸中，不同重复次数出现频率的趋势基本相同，即SSR数量随着重复次数的增加而逐渐减少 (表5)。

图1油茶转录组中SSR基元类型
Fig.1 Type of SSR inC.oleiferatranscriptome

表5 油茶转录组中不同重复次数的SSR数量Table 5 The number of SSR with different repeats in transcriptome of C.oleifera

SSR基序长度对于其多态性的高低具有直接的影响，通常认为长度在20 bp以上的SSR的多态性较高；长度在12～20 bp的SSR的多态性中等；低于12 bp的SSR多态性极低[22]。基于油茶转录组测序获取的104 515个SSR位点的长度分布在10～175 bp之间，平均长度18.66 bp，不同长度的SSR基序分布情况如图2所示。大部分基序长度集中在12～20 bp，共有54 044个，占总数的51.71%；其次是21～30 bp，共有18 309个，占总数的17.52%。超过20 bp的SSR数量占总数的28.15%，低于12 bp的SSR数量占总数的20.14%。结果表明油茶转录组SSR理论上具有中等以上的多态性，预期能够进行相关目的引物的设计与开发，用于油茶遗传多样性、遗传图谱绘制、分子辅助育种等方面的研究。

图2油茶转录组中SSR基序长度
Fig.2 Length of SSR inC.oleiferatranscriptome

3 结论与讨论

基于油茶转录组测序共获得311 283条Unigene，利用MISA进行搜索，共发现104 515个SSR位点，出现频率为33.58%，高于油棕22.60%、四球茶 (Camelliatetracocca) 23.79%、茶树 (Camelliasinensis) 9.63%等物种[23-25]。油茶转录组SSR平均分布距离为1.48 kb，也高于油棕7.19 kb、四球茶2.07 kb、茶树3.68 kb等物种[23-25]。无论是发生频率还是平均分布距离，油茶转录组SSR都相对较高，表明油茶转录组中的SSR种类和数量都比较丰富。此外，和其他物种相比，油茶转录组SSR的平均分布距离和出现频率也存在一定的差异。一方面可能是因为物种的特异性，另一方面可能是不同的搜索参数，搜索工具以及测序技术引起的。

即使相同的物种，其SSR信息特征也可能因为测序技术、转录组测序数据库大小、原始序列等因素出现一定的差异。和前人所做的关于油茶SSR的分析结果相比，此次油茶转录组SSR位点的出现频率、平均距离等指标均呈现出一定的差异。史洁等[17]分析得出油茶基因组中的SSR平均距离是1.85 kb。温强等[19]利用454测序方法得出油茶SSR的发生频率在3.10%～6.70%之间，平均距离在0.63～0.95 kb之间。李海波等[16]研究发现油茶转录组中SSR位点的发生频率为26.75%，平均距离为2.33 kb。这可能是因为不同的测序技术和测序材料造成的。此次测序所用材料主要是湘林系列油茶的叶片，测序方法为Illumina测序技术，而温强等[19]人将浙江红山茶 (Camelliachekiangoleosa) 和短柱茶 (Camelliabrevistyla) 的花芽作为测序材料，测序方法为454测序法，李海波等[16]选择的材料是长林18号的幼嫩叶片，史洁等[17]利用Roche 454测序仪对树龄为100 a的浙江红花油茶古树的叶片和花芽进行测序。

油茶转录组精密型SSRs中以单核苷酸和二核苷酸重复为主，占SSR总数的80.41%。这与先前多个物种的研究结果一致，例如油棕[23]、厚朴 (Magnoliaofficinalis)[22]等物种。根据前人研究，单核甘酸中A/T重复的数量居多，植物中的二核苷酸以AG/CT居多，其次是AT/TA重复[26]。 此次研究发现，A/T、AG/CT、AT/TA分别是单核苷酸和二核苷酸的优势重复基元，这和前人研究结果一致。通常认为双子叶植物中最多的三核苷酸是AAG/CTT重复[19]，然而此次研究发现油茶转录组中最多的三核苷酸类型是ATT/ATT，这和史洁、温强等人关于油茶的研究结果一致，初步分析这一特征是油茶区别与其他物种的特异性表现。温强等人的研究表明油茶中以二核苷酸为主，而此次研究发现油茶中的单核苷酸最多。造成这种差异可能有多种原因：研究中使用不同的搜索、评价标准，有的研究使用序列长度作为主要的搜索参数，有的研究把最小重复次数作为主要的评价标准；不同的测序技术、样品、原始测序数据大小均可能会造成同一物种的SSR信息出现一定的差异。此外，在利用转录组测序技术获得SSR的过程中，也存在序列突变的情况，这也可能会造成SSR搜索的过程中出现信息失真的情况。因此，迫切需要制定一个合理的、统一的SSR搜索检测参数。

SSR长度变化的情况能够直接反映SSR位点获得 (或失去) 重复单元的活跃程度，因而经常作为评价其多态性高低的重要指标[19]。此次研究发现长度位于12～20 bp之间的SSR共有54 044个，占总数的51.71%，表明本研究中油茶转录组SSR 理论上具有中等以上的多态性。可以重点利用这类SSR进行油茶分子标记的开发及遗传多样性等方面的研究。

传统SSR分子标记开发技术效率低，速度慢，且成本高，而转录组测序技术的出现能够低成本、快速、高效地开发大量的SSR标记，未来其有望成为开发分子标记的重要方法。油茶转录组中SSR位点数量多、类型丰富，多态性较高，可用性强，对于加速开发油茶SSR分子标记，开展油茶分子辅助育种、遗传性状分析评价、亲缘关系鉴定、特异资源保护等研究具有重要意义。