嗜盐四联球菌对三文鱼废弃物酿造鱼露的影响

闫文华,欧杰



嗜盐四联球菌对三文鱼废弃物酿造鱼露的影响

闫文华,欧杰*

上海海洋大学 食品学院, 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海), 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 201306

本文以三文鱼加工废弃物为原料，采用外加曲工艺发酵低盐鱼露，对盐度和加曲量进行优化，确定了三文鱼鱼露发酵适宜的条件为：12%的盐度和7%的加曲量。并在此条件下添加嗜盐四联球菌研究其对三文鱼鱼露发酵的影响。结果表明，两实验组总氮含量无明显差别，与未添加组相比，添加嗜盐四联球菌的发酵液中氨基酸态氮、总酸、游离氨基酸含量更高，pH值较低。

嗜盐四联球菌; 三文鱼; 鱼露

三文鱼是英文Salmon的英译，也叫撒蒙鱼，学名鲑鱼，是西餐中常用到的食材，因其肉质鲜美，营养丰富深受消费者喜爱。三文鱼的营养价值非常高，富含18种氨基酸和丰富的不饱和脂肪酸，而不饱和脂肪酸能有效降低胆固醇和血脂，提高脑细胞活性，对心血管疾病的预防起到非常大的帮助[1]。随着生活水平的提高，人们对三文鱼的需求越来越大，市场上的三文鱼通常是以切片的形式进行销售，不可避免会产生大量的加工废弃物，造成渔业资源的浪费[2]。

近年来，利用低值鱼虾及其加工废弃物中丰富蛋白资源制备富含氨基酸多肽的调味品一直是一个国内外研究热点[3]，鱼露属于一个典型代表。鱼露又叫鱼酱油，是我国东南沿海地区以及泰国等东南亚国家常用的调味品[4]。传统鱼露的生产是将盐渍和发酵相结合的，在利用鱼类原料自身酶和微生物对鱼体的蛋白进行分解的同时，利用盐的高渗透压作用抑制腐败微生物的生长，因此传统鱼露往往含盐量在25%到30%左右，存在含盐量过高的缺点。随着人们健康意识的提高，认识到高盐膳食带来的危害，高盐度成了影响传统鱼露发展的一个不利因素。传统鱼露发酵一般需要一年以上，发酵时间过长，为了缩短发酵周期，进行了许多快速发酵的研究，外加曲发酵是其中一种有效的快速发酵方式[5]。乳酸菌例如嗜盐四联球菌，是鱼露发酵的基本微生物，有利于降低pH值并且降低发酵原料发生腐败的危险[6]。

本文以三文鱼加工废弃物为原料，采用外加曲的方式进行发酵，在适宜的盐度和加曲量条件下，加入中国酱油发酵酱醪中分离筛选嗜盐四联球菌（嗜盐乳酸球菌），研究其对三文鱼发酵的影响[7]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

三文鱼加工废弃物：购于三文鱼片加工厂；麸皮：购于农贸市场；沪酿3.042米曲霉；嗜盐四联球菌：华南理工大学生物科学与工程实验室馈赠，从酱油发酵酱醪中分离筛选得到。

1.2 主要仪器与设备

FE20实验室pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；MM12型绞肉机（广东省韶关市北江风驰食品机械设备有限公司）；Kjeltec 8400凯氏定氮仪（丹麦FOSS公司）；YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；0~35%高量程手持盐度计（北京阳光亿事达科技有限公司）；SHZ-DⅢ循化水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；GSP-9270MBE隔水式恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；81-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；日立835型氨基酸自动分析仪（日本日立公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 酱油曲的制备将10%鱼糜和90%的麸皮混合，再加入混合物总量110%的水，混合均匀，分装在500 mL锥形瓶，装料厚度1 cm左右，用棉塞封口，在121 ℃下灭菌蒸汽灭菌30 min，冷却后接入提前在试管斜面活化好的菌种，摇匀，在28 ℃恒温培养，16 h后进行摇瓶防止培养基结块，之后每隔四小时摇瓶1次，使培养基松散，温度均匀，3 d后培养基两面都长满孢子，培养结束[8,9]。

1.3.2 嗜盐四联球菌的培养将实验室-80 ℃冰箱保藏的实验室嗜盐四联球菌菌种在改良番茄汁培养基上活化[10]，挑取单菌落接入100 mL液体培养基扩大培养，培养48 h后，菌液浓度达到108CFU/mL时，离心收集菌体，加入5 mL蒸馏水形成菌悬液备用。

1.3.3 原料处理将冷冻保藏的三文鱼加工废弃物（鱼边、鱼骨、鱼尾）在室温下解冻后，用绞肉机绞碎，取4 kg平均分成四份，放入灭菌锅内采用121 ℃条件蒸汽灭菌30 min，备用。

1.3.4 单因素实验确定基本发酵条件鱼露制备流程：灭菌鱼糜→加入发酵桶→加1.5倍水→加盐、加曲→搅拌→撇去上层油脂→八层纱布封口，室内常温（不高于25 ℃）发酵每天搅拌1次。

1.3.5 嗜盐四联球菌对鱼露发酵的影响鱼露的制备：取4 kg鱼糜平均分成2份，放入灭菌锅内采用121 ℃条件蒸汽灭菌30 min，灭菌后分装在2个5 L发酵桶中，每个桶加入1.5倍的水和12%的粗盐充分混匀，撇去上层红色油脂。待冷后，1号桶仅加入7%的酱油曲，2号桶同时加入7%的酱油曲和5 mL菌悬液，分别搅拌均匀，发酵桶盖上8层纱布封口。室温条件下（不高于25 ℃）发酵，发酵液前一个月每天搅拌1次，之后每隔5 d搅拌1次，至发酵完成。

1.3.6 发酵液的处理将发酵液用定性滤纸抽滤，用所得滤液进行各项指标的测定。

1.4 测定方法

1.4.1 总氮含量采用微量凯氏定氮法[11]

1.4.2 氨基酸态氮采用甲醛滴定法[12]

1.4.3 总酸同上，采用甲醛滴定法

1.4.4 挥发性盐基氮含量（TVB-N）采用全自动凯氏定氮仪测定[13]

1.4.5 pH测定采用pH计测定

1.4.6 游离氨基酸组成测定采用氨基酸分析仪测定

2 结果与分析

2.1 单因素实验确定基本发酵条件

氨基酸态氮是鱼露的营养指标，是蛋白质水解程度高低的特征指标，含量越高，营养越好，质量越好。挥发性盐基氮是由腐败微生物生长产生的，可以通过测定TVB-N值确定鱼露的腐败程度和品质[14]。因此本文在室温条件下以氨基酸态氮含量和挥发性盐基氮含量为测定指标，分别讨论加盐量和加曲量对指标的影响，通过分析得到适宜的三文鱼鱼露的基本发酵条件。

2.1.1 加盐量对鱼露发酵的影响食盐在鱼露发酵过程中起着至关重要的作用，既可以起到杀菌抑制腐败微生物生长的作用，又可以给鱼露带来特别的风味。但食盐摄入量过多会对人体健康带来不利影响，低盐饮食成为趋势，因此低盐鱼露的研究非常有必要。本实验选取8%、10%、12%、14%四个盐浓度发酵鱼露，研究发酵过程中氨基酸态氮和TVB-N含量的变化（见图1、图2）。

图 1 加盐量对鱼露氨基酸态氮含量的影响

图 2 加盐量对TVB-N含量的影响

由图1可知，随着鱼露发酵时间的增加，氨基酸态氮含量总体呈上升趋势，发酵前3 d氨基酸态氮含量显著增加（＜0.05），从第6 d开始增加速率减缓，差异不显著（＞0.05）。在相同的发酵时间，12%盐度下产生的氨基酸态氮含量均显著高于其他处理盐度，14%的盐度下含量最低。这可能是由于，在14%的盐度下，食盐的高渗透压作用，导致蛋白酶活性受到抑制，甚至变性，使得蛋白质的水解程度降低，从而氨基酸态氮的产生缓慢。在12%盐度下，发酵过程产生的氨基酸态氮含量最多，上升速度最快，蛋白质水解程度最高。

由图2可知，随着鱼露发酵时间的增加，TVB-N含量呈上升趋势。前3 d所有实验组均显著增加（＜0.05）。在6~12 d，8%和10%盐度下的TVB-N含量均显著增加（＜0.05），12%和14%盐度下的TVB-N含量上升速率减缓，两者差异均不显著（＞0.05），且TVB-N产生量远低于8%和10%盐度的产生量。说明12%和14%的盐度条件能在一定程度上抑制腐败菌的生长。

通过上述分析可见，在12%的盐度下，鱼露氨基酸态氮生成量最多，TVB-N产生量较少，蛋白质水解程度最高，同时能有效一直腐败微生物，因此确定鱼露发酵的最适盐度为12%。

2.1.2 加曲量对鱼露发酵的影响传统鱼露酿造时间过长，外加曲可以加快鱼露的发酵，同时鱼露可以保持良好的风味[15]。加曲量低，发酵速度缓慢，不能有效缩短发酵时间，加曲量过多也会增加生产成本，因此找到适宜发酵的加曲量也很有研究必要。本文选取3%、7%、10%、12.5%的加曲量进行实验，研究发酵过程氨基酸态氮和TVB-N含量变化（见3、图4）。

图 3 加曲量对氨基酸态氮含量的影响

图 4 加曲量对TVB-N含量的影响

由图3可看出，发酵前3 d氨基酸态氮含量显著增加（＜0.05），在第9 d时达到最高，之后略有下降。在3%和12.5%的加曲量条件下，产生的氨基酸态氮含量低于7%和10%的。说明氨基酸态氮含量的增加和加曲量不成正比，并不是加曲量越多越好。而7%和10%的加曲量下，氨基酸态氮含量相对较高，二者差异不显著（＞0.05）。

由图4可看出，TVB-N含量随发酵时间的增加，显著增加，且加曲量越大，TVB-N含量越高。在不同加曲量条件下，产生的TVB-N含量差异显著（＜0.05）。其中12.5%加曲量产生的TVB-N量最高，3%的最低。

由此可见，7%和10%的加曲量产生氨基酸态氮较高，且差距不显著，但10%加曲量产生的TVB-N远高于7%的，说明10%加曲量下腐败菌生长旺盛，所以综合分析得适宜鱼露发酵的加曲量是7%。

2.2 嗜盐四联球菌对三文鱼废弃物酿造鱼露的影响

通过前期单因素实验确定了鱼露发酵的基本条件，在12%的加盐量和7%的加曲量条件下，比较添加嗜盐四联球菌的外加曲发酵与普通外加曲发酵的各项指标，研究嗜盐四联球菌对三文鱼废弃物鱼露发酵的影响。

2.2.1 发酵过程中氨基酸态氮变化氨基酸态氮以氨基酸形式存在，其氨基酸含量越高，鱼露鲜味越强，氨基酸态氮含量的高低决定了鱼露质量的高低，所以氨基酸态氮也是评价鱼露质量的一个重要指标。发酵过程中氨基酸态氮含量变化见图5。从图5中可以看出，在发酵的前5 d氨基酸态氮含量迅速增加，之后增加速度减缓，但含量总体一直呈上升趋势。随发酵时间的增加，在发酵45 d开始，2号桶的氨基酸态氮含量显著高于1号（＜0.05）。在发酵90 d测得1号和2号样品的氨基酸态氮含量分别是（6.48±0.01）mg/mL和（6.82±0.01）mg/mL，分别符合国家三级和二级鱼露标准。说明嗜盐四联球菌的添加在一定程度上可以提高鱼露中氨基酸态氮的含量。

2.2.2 发酵过程中总氮的变化总氮表示鱼露中存在的有机氮（蛋白质、氨基酸、肽）和无机氮总和，其含量的高低是产品风味的重要影响因素，是鱼露重要的质量指标之一。发酵过程中总氮含量变化见图6。从图6可以看出，在整个发酵过程中鱼露的总氮含量呈上升趋势，在发酵初期上升比较快，到发酵后期趋于平缓。对比1号和2号样品，含量差异均不显著（＞0.05）。可见，嗜盐四联球菌的添加对鱼露发酵总氮含量没有明显影响，并没有明显提高总氮含量。

图 5 发酵过程氨基酸态氮的变化

图 6 发酵过程总氮的变化

2.2.3 发酵过程中pH值和总酸的变化发酵过程pH和总酸变化见图7、图8。从图7中可以看出，在整个发酵过程pH呈下降趋势，发酵初期pH迅速下降，之后下降速度减缓。对比1号和2号样品，在整个发酵过程添加嗜盐四联球菌的2号样品pH值均低于1号，差异显著（＜0.05），说明嗜盐四联球菌在发酵过程产酸使发酵液pH保持在较低值，而较低的pH有助于抑制腐败微生物的生长，减少有害代谢产物的产生，有益于鱼露的保存。

总酸是影响鱼露风味的一个重要指标，其含量与鱼露的呈味有关，由图8可看出，在整个发酵过程中，总酸含量呈上升趋势，从发酵后期开始2号样品的总酸含量均高于1号样品，差异显著（＜0.05），说明嗜盐四联球菌的添加可以在一定程度上增加总酸含量，但又不会使总酸含量过高。

图 7 发酵过程pH值的变化

图 8 发酵过程总酸的变化

2.2.4 发酵100 d后发酵液中的游离氨基酸组成比较发酵液中的游离氨基酸组成进行测定（见表1）。

鱼露作为一种特殊的氨基酸调味品，其中的鲜味尤为重要[16]。鱼露中的鲜味主要是由蛋白质分解形成的氨基酸和肽类，有机酸和核酸关联物对鱼露呈味也有一定的影响[17]。检测的18种氨基酸种，除谷氨酸外与鲜味相关的氨基酸还包括天门冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸等。其中谷氨酸是鱼露鲜味的主要来源，含量越高，鱼露滋味越鲜美[18]。测得未添加嗜盐四联球菌的1号桶和添加嗜盐四联球菌的2号桶中的氨基酸总量分别是45.01 mg/mL和51.71 mg/mL，这可能是由于嗜盐四联球菌在生长过程中产生大量的乳酸和乙酸，降低了2号发酵液中pH值，抑制腐败菌的生长，促进了米曲霉和一些酵母菌的生长，从而促进蛋白质的水解。经对比2样品中的天门冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量存在明显差异，2号样品含量均高于1号样品。而丝氨酸、精氨酸的含量1号样品高于2号样品。说明添加嗜盐四联球菌发酵的鱼露呈鲜味的天门冬氨酸和谷氨酸含量更高，氨基酸总量也略高于未添加组。

表 1 鱼露游离氨基酸组分

3 结论

本文以三文鱼加工废弃物为原料，采用外加曲工艺发酵低盐鱼露，对影响发酵的2个因素——盐度和加曲量进行优化，并在最优条件的基础上添加嗜盐四联球菌，研究其对三文鱼低盐鱼露发酵的影响。结果表明，三文鱼的发酵最优条件为：12%的盐度和7%的加曲量。添加嗜盐四联球菌组和未添加组的总氮含量无明显差别；与未添加组相比，添加嗜盐四联球菌的发酵液中氨基酸态氮和总酸含量高，pH值低，游离氨基酸总量高，鲜味氨基酸谷氨酸和天门冬氨酸也远高于未添加组。说明嗜盐四联球菌的添加使得三文鱼鱼露营养更丰富，风味更鲜美，更易于保存，并且在此实验条件下可以实现低盐鱼露的酿造。

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Effect ofon Fish Sauce Fermented with Wastes after Salmon Production

YAN Wen-hua, OU Jie*

()201306,

In this research, with the salmon processing waste as raw material, low salt fish sauce was fermented by adding koji technology. By optimizing salinity and the percentages of koji, the suitable fermentation conditions of salmon fish sauce were determined: 12% salinity and 7% koji addition. Under these conditions, the effect ofon the fermentation of salmon fish sauce was studied. The results show there was no significant difference in total nitrogen content between the two groups. But compared with the group without, the content of amino acid nitrogen, total acid and free amino acid in the fermentation broth ofwas higher, and the pH value was lower.

; salmon; fish sauce

TS264.2

A

1000-2324(2018)06-0911-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2018.06.001

2017-02-29

2017-04-27

闫文华(1989-),女,硕士研究生.研究方向为发酵食品. E-mail:1327047669@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jou@shou.edu.cn