黄精降低活性氧水平促进衰老内皮祖细胞功能的研究

秦 臻，韦正新，宰青青，许键炜，2

(贵州医科大学基础医学院1. 药理学教研室、2. 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550025)

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类可替代修复损伤血管内皮，促进血管网络重建的内皮细胞前体细胞，利用体外扩增的EPCs治疗缺血性心血管疾病具有较好的应用前景[1-2]。然而，EPCs在体外传代培养中常因老化而难以维持增殖，如何干预EPCs的衰老，提高EPCs的数量和质量，是临床治疗缺血性心血管疾病急需解决的一个难点。前期研究表明，黄精可通过提高端粒酶活性来保护衰老大鼠骨髓EPCs的功能[3]，在此基础上，本文将进一步探讨黄精在老年大鼠骨髓EPCs体外传代培养衰老进程中，对细胞功能及活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康SPF级20月龄SD大鼠20只，体质量(520～580) g；3月龄SD大鼠40只，体质量(220～260) g，♀♂各半。全部动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：11400700111130。动物饲养环境：温度(22～25) ℃，湿度50%～60%，光照12 h，采用标准鼠饲料和灭菌饮用水喂养。本动物实验方案获得贵州医科大学动物伦理委员会批准。

1.1.2药物与试剂 黄精(批号：20150525)购自贵州百灵药业；M199培养液(批号：NAA1326)购自Hyclone公司；胎牛血清(批号：A15112-0279)购自PAA公司；大鼠淋巴细胞分离液(批号：TBD 2013LR)购自天津灏洋生物科技有限公司；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，批号：011210)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，批号：081308)购自PeproTech公司；Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil labeled acetyl low density lipoprotein，Dil-ac-LDL，批号：YB-0013)购自广州奕源生物科技有限公司；FITC标记的荆豆凝集素1(FITC-labeled Ulex europarus agglutinin-1，FITC-UEA-1，批号：055M4077V)购自Sigma公司；β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自Biovision公司；体外成血管试剂盒购自Millipore公司；ROS检测试剂盒购自碧云天公司。

1.1.3仪器 TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)；IX71荧光显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)。

1.2方法

1.2.1黄精含药血清的制备 黄精产自贵州，经贵阳市药检所鉴定为道地药材，按《中国药典》(2005)制备黄精水煎液，水浴浓缩备用。将3月龄SD大鼠随机分为对照组、黄精高、中、低剂量组，每组10只。灌胃药量按人与动物体表面积换算，即低剂量组为临床等效剂量2 g·kg-1，中剂量为5倍临床等效剂量即10 g·kg-1，高剂量为10倍临床等效剂量即20 g·kg-1，对照组灌服生理盐水。每天灌胃2次，连续3 d，d 4早上1次性灌服全天剂量后采血，离心取上清，过滤除菌。

1.2.2大鼠骨髓EPCs的培养鉴定及细胞分组 将20月龄健康SD大鼠麻醉处死后，无菌取出双侧胫骨、股骨，采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，PBS洗涤2次，用M199全培养基(含体积分数为0.2的胎牛血清，10 mg·L-1的VEGF和bFGF)重悬后，接种于24孔板中，每隔3 d换液1次，收集培养第2代的细胞，与Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1共同孵育，采用双染色法鉴定EPCs。将培养第2代的细胞同步化24 h后，随机分为4组：对照组加入空白血清，黄精各剂量组加入黄精高、中、低剂量含药血清，使各组血清的体积分数为0.1，每隔3 d换液1次，继续培养至第4、6、8代，分别检测以下指标。

1.2.3细胞衰老程度检测 按β-半乳糖苷酶染色试剂盒操作说明，PBS洗涤细胞1次，加入1 mL固定液，室温固定15 min；PBS洗涤细胞3次，每次3 min，加入1 mL预热的染色工作液，37 ℃无CO2条件下孵育，直到细胞呈现蓝色，用封口膜封住孔板防止液体蒸发，除去染色工作液，加入2 mL PBS缓冲液洗涤，荧光显微镜下随机选取5个视野(×200)，每个视野至少100个细胞，胞质染色者为衰老细胞，计算衰老细胞占观察细胞总数的百分比。

1.2.4细胞增殖功能检测 将等量EPCs接种在96孔培养板中，贴壁24 h后，每孔加5 g·L-1的MTT 15 μL，继续培养4 h，吸弃上清液，再加入DMSO，于微量震荡器充分震荡10 min后，置酶标仪，于波长570 nm处测吸光值。

1.2.5细胞迁移功能检测 消化收集贴壁细胞，将等量EPCs加入Transwell小室的上室，下室加入含50 mg·L-1VEGF的M199培养液，培养24 h，擦去上室中的细胞，多聚甲醛固定，吉姆萨染色，镜下随机选取5个视野(×200)，计数迁移至下层的细胞，取其平均数。

1.2.6细胞成血管功能检测[4]EPCs成血管功能与增殖、黏附及迁移功能密切相关，按体外血管生成试剂盒操作说明，将ECMatfixTM胶液和ECM 10×稀释液置于4 ℃冰箱过夜冻融，每900 μL ECMatfixTM胶液加入ECM 10×稀释液100 μL，将混匀液加入96孔板，每孔50 μL，孵育1 h凝固成胶；将各处理组细胞以5×103个/孔接种于胶上；37 ℃培养24 h后，镜下随机选取5个视野(×200)，计数长度为宽度的4倍以上的细胞，取其平均数。

1.2.7细胞ROS水平的检测 按ROS检测试剂盒操作说明，胰酶消化收集各组细胞，计数后，每管加入1 ∶1 000用无血清培养液稀释的2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH)，使每管终体积为100 μL，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤2次，上流式细胞仪检测。

2 结果

2.1大鼠EPCs的分离培养及鉴定刚分离的大鼠骨髓单个核细胞呈圆形，传代培养至第2代时细胞呈典型的铺路石样，贴壁细胞经FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL处理后，荧光显微镜下同时结合FITC-UEA-1和摄取Dil-ac-LDL的细胞为正在分化的EPCs(Fig 1)。

Fig 1 Identification of EPCs(×200)

A: Adherent cells with Dil-ac-LDL are red; B: Cells binding FITC-UEA-1 are green; C: Double positive cells are differentiating EPCs

2.2黄精对EPCs衰老程度的影响β-半乳糖苷酶染色阳性细胞即为衰老细胞，Fig 2结果显示，随细胞传代次数增多，细胞染色阳性率明显上升(P<0.01)，经黄精各剂量干预后，细胞在传代培养中染色阳性率明显下降(P<0.05)。

Fig 2 Effect of RP on positive rate of β-gal in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs4th passage in control group

2.3黄精对EPCs增殖功能的影响如Fig 3所示，随细胞传代次数的增多，细胞增殖功能明显降低(P<0.01)，经黄精各剂量干预后，细胞增殖功能明显增强(P<0.01)。

Fig 3 Effect of RP on proliferation in

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs4th passage in control group

2.4黄精对EPCs迁移功能的影响如Fig 4所示，随细胞传代次数的增多，迁移细胞数量明显降低(P<0.01)，经黄精各剂量干预后，迁移细胞数量明显上升(P<0.01)。

Fig 4 Effect of RP on migration in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs4th passage in control group

2.5黄精对EPCs成血管功能的影响如Fig 5所示，随细胞传代次数的增多，成小管细胞数量明显降低(P<0.01)，经黄精高、中剂量干预后，成小管细胞数量明显增多(P<0.01)，黄精低剂量仅能增强第4代的细胞成血管功能，对第6、8代细胞成血管功能无明显影响。

Fig 5 Effect of RP on tubule formation in

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs4th passage in control group

2.6黄精对细胞ROS水平的影响流式细胞仪检测到的DCFH荧光强度可反映细胞ROS的水平，且呈正相关。Fig 6结果表明，随细胞传代次数增多，其ROS水平迅速上升(P<0.01)，经黄精各剂量干预后，细胞ROS水平明显降低(P<0.01)。

3 讨论

EPCs是一类具有巨大增殖潜力的内皮细胞前体细胞，在血管损伤、缺血缺氧等条件下，EPCs不仅可向损伤血管迁移募集，参与受损内皮的修复及血管网络的构建，还能分泌多种细胞因子，促进血管的修复重建。因此，由EPCs介导的缺血性心血管疾病的治疗已成为目前再生医学研究的热点[1-2,5]。

Fig 6 Effect of RP on level of ROS in

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs4th passage in control group

然而，EPCs会随机体衰老出现老化迹象，这主要由年龄、遗传、端粒酶等决定[3, 6]。同时，EPCs在体外培养过程中也会出现复制时间延长，甚至停滞等老化迹象，这可能是因为细胞在短期内不断复制，又无体内环境的保护，多种外界局部因素对细胞的各种有害刺激逐渐积累所致。本研究也表明，取自老年大鼠骨髓的EPCs在体外传代培养过程中迅速衰老，并伴有细胞功能的明显衰退。

衰老自由基学说认为，衰老过程是机体组织细胞不断产生自由基积累的结果。活性氧类是细胞氧化系统产生的含有ROS功能基团的化合物，也是体内最重要的自由基。正常情况下，细胞内ROS的产生和清除处于平衡，但在细胞衰老进程或刺激因子存在时，其胞内清除ROS的调节机制失衡，积累增多的ROS又会损害细胞功能，加速细胞衰老[7-8]。可见，ROS的异常增多是加速EPCs衰老的一个关键因素。本研究也表明，EPCs在体外传代培养老化进程中伴有ROS异常迅速增多，而增多的ROS又可继续加重EPCs老化，并损伤EPCs功能。

黄精是疗效确切的抗衰老中药，现代药理学研究已表明，黄精及其主要成分黄精多糖可增强机体抗氧化功能，有效清除自由基，减轻炎症损伤反应；可有效提高EPCs的端粒酶活性，延缓在体EPCs的衰老[3, 9-10]。本研究进一步表明，黄精可有效干预老年大鼠EPCs的体外传代培养老化进程，其机制可能是通过降低细胞ROS水平，减轻细胞氧化损伤来保护衰老进程中EPCs功能。由于线粒体是ROS产生的主要场所，也是ROS作用最敏感的部位，线粒体功能损伤是ROS异常增多最主要的原因之一，与细胞衰老关系密切，黄精是否可以通过维护线粒体功能来达到抗EPCs衰老的机制，尚待后续研究。