欧前胡素抗抑郁作用及机制研究

郑星星，刘嘉辉，刘明辉，程 颖，曹艳君, 2

(西北大学生命科学学院1. 西部资源生物与生物技术教育部重点实验室、2. 陕西省生物医药重点实验室，陕西 西安 710069)

抑郁症是一种情感障碍类疾病，在中国医学属于抑郁类病症的范畴，从青少年时期开始发病，具有高发病率和高自杀率，严重威胁人类健康。其发病机制不明，致使抗抑郁的药物疗效有限[1]。近年来，中医、中药作为研究抑郁的发病机制以及抗抑郁药用资源，引发了人们广泛的关注[2]。尽管抑郁症的确切病因及病理机制尚不清楚，但在前人的研究基础上，已形成了多种有关抑郁症的神经生物学假说，包括单胺能假说、神经退行性假说、细胞因子假说等，其中基于5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)系统的单胺类递质失调假说在研究抑郁发生机制中起到重要作用[3]。

5-HT作为一种抑制性的神经递质，在大脑皮层及神经突触内含量极高，必须通过相应受体的介导才能产生作用。大量研究表明，5-HT1A受体在抑郁的发病与抗抑郁行为中起调节作用，可能作为抗抑郁药的作用靶点[4-5]。脑内5-HT1A受体能调节应激适应过程，而且对应激刺激引起的情感障碍具有保护作用。与5-HT1A受体不同的是，5-HT转运体只有一种5-HT转运蛋白(serotonin transporters, 5-HTT)。5-HTT清除突触间隙的5-HT含量，决定了突触后受体介导信号的量以及持续时间，在5-HT神经传递系统具有重要作用[3]。也正因如此，5-HTT的表达也与抑郁症密切相关。氟西汀作为一种选择性的5-HT重摄取抑制剂，在抑郁症、抑郁障碍等方面都有较好应用[6]。因此，在本实验中，将氟西汀作为阳性药使用。欧前胡素(imperatorin, IMP)是从中草药白芷中提取分离的呋喃香豆类化合物，用于保持传统抗癫痫药剂的活性，改善认知损伤，此外还有抗惊厥和镇静催眠作用[2,7-8]。目前，IMP作用于情绪障碍的研究有所进展，但在产前应激(prenatal stress, PS)引起的抑郁样作用未见报道。本实验拟通过产前束缚应激模型，建立子代抑郁模型，探究IMP对PS子代大鼠的抗抑郁作用及相关机制。

1 材料

1.1实验动物Sprague-Dawley(SD)大鼠，购买于西安交通大学动物研究中心。在西北大学SPF动物房饲养，使用许可证号：SYXK(陕)2010-004，室温控制在(23～27)℃，湿度50%～60%，昼夜各12 h，提供充足的水和食物。

1.2药物与试剂IMP(陕西慧科植物开发有限公司)，经高效液相色谱测定，其纯度>98%；氟西汀(常州四药,生产批号：201711161)；5-HT ELISA试剂盒(美国ADL公司); RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(宝生物工程有限公司)。

1.3仪器光学显微镜(日本Olympus公司); 酶标仪(美国PerkinElmer公司)；大鼠束缚应激容器(西安玻璃制品厂); 摄像机(日本东京Sony公司); 实时定量PCR仪(Bio-Rad公司); 离心机(德国Eppendorf公司)。

2 方法

2.1动物分组与造模SD大鼠以3 ∶1将♀大鼠(250±20)g与♂大鼠(280±20)g进行合笼。次日清晨进行阴道涂片检测，如果涂片有精子呈阳性，记为妊娠d 0，怀孕的♀鼠单独饲养。在♀大鼠怀孕的d 14～20进行单独的束缚应激(将孕鼠放入1个瓶底和瓶盖都开孔、通气的透明瓶子里，1 d 3次，每次45 min，每次束缚应激间隔时间不少于2 h，直径6.8 cm)。♂子代大鼠分为5组，每组8只。分别是正常组、模型组、阳性组、IMP低、高剂量组(15、30 mg·kg-1·d-1)。正常组与模型组每天灌服等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)，阳性组灌服盐酸氟西汀溶液(10 mg·kg-1·d-1)。给药组从子代出生后d 30开始，灌胃给药4周，使用0.5%的CMC-Na溶解IMP。

2.2糖水偏好实验测定前禁水、禁食24 h，测定4 h饮用2%蔗糖溶液的量[9]，糖水偏好的计算公式为：糖水消耗量/总液体消耗×100%。

2.3强迫游泳实验水温(23～25) ℃的圆桶(桶高50 cm，直径20 cm)水深40 cm，强迫游泳8 min，记录大鼠的不动时间(s), 大鼠在水中处于被动漂浮，同时停止挣扎达到3 s以上，则认为大鼠为不动状态。不动时间的计算公式为：不动时间/总时间×100%。

2.4旷场实验旷场箱为白线5×5等分(150 cm×150 cm×49.5 cm，四壁涂为黑色，底部绿色), 箱子的中心区域(3×3=9的方块)再细分为1个大的中心区域和8个小的中心区域，每次放入1只大鼠在小的中心区域的同一侧，观察大鼠的行为，记录5 min内大鼠在中心区域逗留的时间，穿越总格子数、穿越中心格子数、直立次数以及理毛次数。

2.5ELISA实验行为学结束后，对5组♂子代大鼠断头取脑，分离出前额叶皮层和海马，并用液氮冰冻，-80 ℃保存。按照ELISA说明书，使用相对应定量的抗体对5-HT含量进行测定，将样品加入到预先涂有一抗的96孔板的每一个孔里，之后每个孔加入生物素结合试剂和酶结合试剂，将孔板在37 ℃孵育30 min，将板子用蒸馏水清洗5次，并用酶标仪测量，数据以ng·g-1的蛋白含量显示。

2.6RNA提取和实时定量PCR总RNA用TRIzol法从组织中提取，使用纳米级分光光度法进行定量。每个mRNA样品使用随机引物和逆转录试剂盒提取1 μg合成cDNA链。使用SYBR Green real-time PCR Master Mix扩增5-HTT、5-HT1AR PCR产物。大鼠特异性引物5-HTT 正向序列：5′- GGCGGAGATGAGGAATGAAG-3′，反向序列：5′-AAGAAGATGATGGCAAAGAACG-3′；5-HT1AR正向序列：5′- CCACGGCTACACCATCTAC-3′，反向序列：5′- TGACAGTCTTGCGGATTCG -3′。

3 结果

3.1IMP对PS子代大鼠体质量的影响如Fig 1所示，与对照组相比，IMP给药组或者氟西汀组的子代♂大鼠体质量在d 0、7、14、21、28并没有明显变化。

Fig 1 Chemical structure(A) and effect of IMP on bodyweight in prenatally stressed male offspring rats(B)

3.2IMP对PS子代大鼠糖水偏好的影响如Tab 1所示，与对照组相比，PS组子代♂大鼠对2%的糖水消耗百分比明显减少(P<0.01)。IMP组和氟西汀组的子代♂大鼠糖水偏好百分比明显增长(P<0.01)，IMP给药组与氟西汀组比较差异无显著性。

Tab 1 Effects of IMP on sucrose-preference test in prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

3.3IMP对PS子代大鼠强迫游泳的影响如Tab 2所示，与对照组相比，PS组不动时间和不动时间百分比明显增加(P<0.01)。IMP组和氟西汀组的子代♂大鼠不动时间和不动时间百分比都明显减少(P<0.05，P<0.01)，IMP给药组与氟西汀组比较差异无显著性。

3.4IMP对PS子代大鼠旷场实验的影响如Tab 3所示，PS组穿越总格子数、穿越的中央格子数、直立次数、理毛次数较对照组明显减少(P<0.01)。

Tab 2 Effect of IMP on forced-swimming test in prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

IMP组和氟西汀组的子代♂大鼠穿越总格子数、穿越的中央格子数、直立次数、理毛次数均明显增加(P<0.05，P<0.01)，IMP给药组与氟西汀组比较差异无显著性。

3.5IMP对PS子代大鼠海马和前额叶皮层中5-HT浓度的影响如Fig 2所示，PS组的5-HT浓度明显低于对照组(P<0.01)。IMP给药4周后，能够明显逆转PS子代大鼠海马和前额叶皮层组织中5-HT的浓度(P<0.05，P<0.01)，与氟西汀组的结果有着相同的趋势，差异无显著性。

Fig 2 Effect of IMP on 5-HT concentration in hippocampus andfrontal cortex of prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsPS

3.6IMP对PS子代大鼠海马和前额叶皮层中5-HTT、5-HT1ARmRNA表达的影响如Fig 3所示，与对照组相比，PS组5-HT1AR mRNA表达明显减少，而5-HTT mRNA的表达明显增加(P<0.05，P<0.01)。与PS组相比，IMP给药4周后，5-HT1AR mRNA表达明显增加，而5-HTT mRNA表达明显减少(P<0.05，P<0.01)，IMP给药组与氟西汀组比较差异无显著性。

4 讨论

随着社会经济的快速发展，人们长期承受来自工作、生活、家庭等各种压力，过度长期应激可增加人们精神负担、不良情绪和疾病的易患性，特别是某些特定生理阶段应激对健康的影响更为明显。妊娠期是妇女生活的重要时期，是女性应激的易患期。临床资料显示，新生儿及成年后焦虑、抑郁、认知障碍等疾病发病率的不断升高，与母代在妊娠期遭受慢性应激有关。有研究表明，孕妇处于长期情绪困扰，可增加子代焦虑、抑郁等情绪障碍的发病率[10]。动物实验也表明，产前应激后的子代大鼠表现出明显的焦虑及抑郁样行为。IMP是一种广泛存在于白芷、川芎、香菜等中药及食材中的呋喃香豆素类化合物，已被证明具有抗炎、舒张血管、抗惊厥、镇静催眠等功效[11]。在本实验研究发现，与对照组相比，IMP组或者阳性药氟西汀组的子代♂大鼠体质量在d 0、7、14、21、28并无明显变化。通过4周的IMP灌胃给药，可明显上调子代抑郁♂大鼠的糖水偏好度、强迫游泳不动时间、穿越总格子数、穿越中间格子数、直立和理毛次数。提示IMP可明显改善♂子代大鼠抑郁样行为。

Tab 3 Effect of IMP on open-field test in prenatally stressed male

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 3 Effect of IMP on 5-HTT(A) and5-HT1AR(B) mRNA expression in hippocampus andfrontal cortex of prenatally stressed male

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsPS

抑郁病的发病机制与遗传、神经递质紊乱、激素异常、不良社会心理因素等一系列因素相关，由这些因素导致的5-HT缺乏是普遍认可的抑郁症发病机制之一。由于5-HT1A受体被看作应激调节过程的一个重要媒介，在应激引起的抗精神紊乱过程中起保护作用。与此同时，5-HT的摄取过程由5-HTT控制，所以研究5-HT1AR、5-HTT对了解抑郁症发病机制有重要意义。5-HT浓度的增加有助于海马神经形成，从而使抑郁症得以改善，促进抑郁样行为的恢复[12]。多数研究和抑郁症自杀者的尸检结果证实，在抑郁症患者脑内，分布于皮质-边缘系统的突触后5-HT受体表达降低，结合能力下降[4]。本实验结果表明，IMP可以提高海马及前额叶皮层中5-HT浓度及5-HT1A受体的mRNA表达，并下调5-HTT mRNA表达。IMP对5-HTT的下调可能与降低5-HT的再摄取有关，从而增加5-HT的浓度。这表明IMP抗抑郁作用可能与5-HT的浓度以及5-HT1AR、5-HTT mRNA的表达量有关。

研究发现，IMP可以抑制尼古丁引起的焦虑，并改善学习记忆行为[13]。此外，IMP还可通过改变谷氨酸释放，改善癫痫发作[14]。IMP不仅广泛存在于常见中草药白芷中，而且在烹调香料如香菜、茴香中也有较高含量。本研究结果表明，IMP可明显降低产前应激引起的子代抑郁样行为，其机制可能与5-HT能神经系统有关，提示IMP可能可以作为一个潜在用于预防和治疗抑郁样行为的药物。