明胶微球的制备及其在口腔医学领域的应用*

王德飞 秦 爽 刘 红

微球(microspheres，MS)是一种将药物分子包裹于高分子聚合物中以实现药物长时间平稳释放的缓释药物传递系统，是粒径尺寸大小分布在5～250μm 之间的球状实体[1]。制备微球的材料有明胶、海藻酸钠、聚乳酸(polylactide，PLA)、聚乳酸·羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)等[2]。其中，明胶是应用最广泛的微球材料之一。明胶微球具有制备简便、价格低廉、载药量高、分散性好、组织相容性好和生物可降解性等多种优势[3]。尤其在口腔颌面骨缺损的修复、种植修复、牙髓再生、牙周组织再生领域被用作载体时，在提高生长因子和药物稳定性、减缓突释等方面取得较为理想的效果。制备明胶微球的常用方法有乳化溶剂萃取法、相分离法、喷雾干燥法、膜乳化法[4]。

1.制备方法

1.1 乳化溶剂萃取法 乳化溶剂萃取法是制备微球应用最广泛的方法。首先将制备微球的材料在有机溶剂中溶解，形成油相；油相通过均匀化和超声等物理方法在含有乳化剂的连续水相中乳化，溶剂萃取进入水相，然后蒸发溶剂、过滤、洗涤和冻干得到微球。根据用于微球制备的乳化液数量，乳化溶剂萃取法可分为单乳溶剂萃取法和双乳溶剂萃取法[5-8]。该方法主要优点是不需要任何专门的设备可以在广泛尺寸范围内批量生产微球，并且可选择合适的溶剂将生物活性分子封装在微球材料中，但是此方法的成本较高，难以控制微球的粒径分布，水溶性生物活性分子(如蛋白质)的包封效率相对较低[4]。

1.2 相分离法 将制备微球的材料溶解在溶剂中，然后将溶液通过注射器/针头或压电喷嘴滴加到液氮中，将温度降至低于溶剂的冰点使相分离；通过升华或浸出去除溶剂，生成具有多孔形态特征的微球[9]。该制备方法简单可行，但易受溶液浓度和控制温度的影响。

1.3 喷雾干燥法 将制备微球的材料溶解于低沸点的有机溶剂中，形成单相或多相的胶体；然后将溶液雾化、氮气干燥，通过对干燥室进出口温度调整可以制备不同形态的微球[10]。一般情况下，喷雾干燥法制备的微球受工艺参数的影响很大，其粒径和产率主要受聚合物浓度和泵速的影响[11]。

1.4 膜乳化法 以聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠为连续相，将制备微球的材料溶于二氯甲烷成为分散相，通过施加氮气压力形成均匀液滴；然后通过微搅拌的连续相流动分离出液滴形成O/W 乳液；最后蒸发二氯甲烷、液滴凝固，获得均匀的微球。膜乳化过程中获得均匀液滴的关键是分散相与亲水性膜之间高的界面张力，否则液滴会在膜上扩散，难以自发分离。膜乳化法的最大优点是获得高包封率的均匀微球，并可通过选择微球尺寸来调控微球的释放行为，而且温和的制备条件可以保持蛋白质/肽类药物的生物活性[12]。

明胶微球具有优良的性能及多样化的制备方法，为其在口腔领域的应用提供了条件。下面，就目前利用不同方法制备的明胶微球在口腔医学领域中的应用进行阐述。

2.应用

2.1 口腔颌面外科领域应用 针对颌骨的骨缺损，以往多采用全身性的药物治疗，但全身用药常伴随一定的并发症，因此可以考虑局部应用促进成骨的各类生长因子对其进行治疗。

降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)对局部调控骨代谢起着重要作用，不仅可以促进成骨细胞中环磷酸腺苷的形成，刺激骨髓干细胞有丝分裂和间充质细胞的分化，而且能通过与破骨细胞的降钙素受体结合来抑制破骨细胞的骨吸收活性[13]。刘伟等[14]利用乳化交联的方法制备负载不同浓度的CGRP 的明胶缓释微球，并将其植入骨质疏松兔的股骨缺损中。组织学显示CGRP在浓度为10-6mol/L 时其新生骨组织比例最高。最终结果证明负载CGRP 的明胶缓微球的缓释时间可达20 天且有效地促进骨质疏松兔骨质缺损区的成骨。

类胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)可明显提高生物材料的生物活性，促进有丝分裂，刺激成骨细胞的增殖及胶原合成，促进骨折的愈合，且有时间和剂量依赖性[15]。落全祥等[16]用乳化交联法制备IGF-1/明胶微球复合物，平均粒径为(20.33±3.67)um，将其置于兔下颌骨缺损处以作为实验组。对照组植入空白明胶微球(GMs)。从血清学方面观察其对兔下颌骨缺损修复的影响。研究表明IGF-1/GMs12 天时IGF-1累计释放率达93%，能促进颌骨缺损早期愈合。

乳铁蛋白作为一种新型的骨生长因子，通过调节骨的生长和代谢过程发挥功能，促进骨骼生长。Ulas,Görmez 等[17]用乳化交联法制备加载牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin，bLF)的明胶微球，观察其与有机牛骨结合后在骨骼再生上的作用。结果表明明胶微球作为载体24 天内释放了约3mgbLF，有利于发挥bLF 促进成骨细胞活性的作用，并且通过增加微球的交联密度，可以将bLF 释放的持续时间从几个小时延长至几周。

2.2 种植、修复领域应用 口腔种植领域最新研究热点主要是如何改进种植体表面处理方式在达到促进早期骨结合目的的同时，降低种植体周围感染的发生。钛及其合金材料由于具有良好的生物相容性和机械性能，现已广泛用于牙植入体、骨科及整形外科等领域。尽管钛基植入材料具有优良的性能，但其存在的骨整合性差和细菌感染问题，往往会导致临床植入手术的失败。

有资料显示，电泳沉积是一种利用溶剂中带电粒子或分子在基片材料表面聚集的处理技术，广泛适用于处理生物分子和生物实体的表面[18]。电泳沉积技术因其成本相对低廉、所需设备简单、能在室温和高纯度条件下对材料进行加工，以及能够产生大范围的涂层厚度和包覆复杂的三维和多孔结构等优点，在生物医学领域引起了越来越多的关注[19]。研究显示通过电泳沉积技术在钛表面成功地制备的壳聚糖/明胶涂层，为进一步负载功能性分子提供了基础[20]。

研究证明骨保护素(osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG)可以有效预防骨吸收[21]。基质细胞衍生因子(SDF-1)/基质细胞衍生因子受体(CXCR4)被证实参与组织再生和器官形成，越来越多的证据表明SDF 对于牙齿以及骨骼的组织再生或修复起着不可或缺的作用[22]。马瑞[23]采用振荡渗涂交联法将双层包载重组人骨形成蛋白-2(Recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)/SDF-1/OPG 明胶微球交联于纯钛微弧氧化涂层的微孔中，成功制备出新型功能性涂层。研究显示：新型功能性涂层不仅表面形貌良好，pH 值在7.4 时30 天内三种因子释药率可达80%，并且具有一定的促进骨髓间充质干细胞募集归巢、促进其向成骨分化的能力以及一定的抑制破骨细胞分化成熟的作用。

种植体周围炎对种植体的长期稳定产生很大的影响，会引起骨吸收甚至种植失败[24]。研究表明种植体周围炎的发病率高达47%[25]。牙周炎患者较牙周健康人群对种植体周围炎有着更高的易感性，研究表明有牙周炎病史的患者相较于牙周健康患者，种植后长期效果不佳，表现为探诊深度更大，边缘骨吸收严重，以及种植体周围炎发生的可能性增加[26]。Lu han[27]等制备了负载骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein2，BMP-2)和万古霉素(Van)的GMs-GO/Ti 支架缓释系统。研究表明Van 在GMs-GO/Ti 支架上表现为缓释，21d 后释放率为63.4±3.4%；纯Ti 支架中BMP 2 的释放速率高于GMs-GO/Ti 支架材料的BMP-2 释放速率。用GMs 分别包封小分子药物和蛋白质，可以使药物和蛋白质得到有效的释放。利用了GMs 的高承载能力和GO 的高比表面积，赋予支架具有骨诱导和抗菌双重功能，满足骨组织再生的要求。

2.3 牙体牙髓领域的应用 再生牙髓学的目标是实现牙髓牙本质复合体的再生。牙髓干细胞在牙体组织再生过程中具有巨大的潜在价值[28]。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)被认为在牙源性分化中扮演着重要的角色。Srisuwan T[29]建立了一个研究牙髓干细胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)存活和生成牙髓组织潜能的体内模型。将DPSCs 与含或不含缓释骨形态发生蛋白-4(BMP-4)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)的明胶微球混合。明胶微球的孔隙率为94.24±0.52%，表观密度为94.24±0.52%。30 天内累计缓释率达90%。细胞悬液被移植到大鼠腹股沟带血管蒂的组织工程室，2 周后，观察到腔内新生组织和新生血管的形成。在牙本质周围，特别是血管蒂周围和明胶微球附近发现DPSCs。移植8 周后细胞存活。牙本质涎磷蛋白阳性基质的产生，显示出牙髓祖细胞的再生功能。本研究证明了该组织工程模型在研究大鼠牙髓细胞及其在牙髓再生方面的潜力，为利用这一技术寻找替代疗法提供了可能。

全根管牙组织再生一直是再生牙髓学领域面临的最大挑战之一，也是其临床应用的最大障碍之一。Li X 等[30]设计并合成了一个独持的层次化负载生长因子的纳米纤维微球支架系统。在该体系中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与肝素结合，被包裹在肝素偶联的明胶纳米球中，并在可注射左旋聚乳酸(poly(Llactide)，PLLA)微球的纳米纤维中进一步固定。这种分层微球系统不仅可以避免VEGF 变性和加速降解，而且可以很好地控制其持续释放。此外，纳米纤维PLLA 微球融合了细胞外基质模拟结构和多孔注射形式，有效容纳DPSCs，支持其增殖和牙髓组织形成。体内研究显示，髓样组织在整个根尖和根中三分之一成功再生，并达到了全根管冠方三分之一。

2.4 牙周领域应用 牙周组织工程是本世纪初提出的一种基于分子生物学和细胞生物学的牙周再生新范式。实现牙周再生是治疗晚期牙周炎所致牙周缺损的重要临床目标。牙周再生是一个复杂的过程，涉及到各种细胞类型的分化，并在正确的位置和环境中产生足够数量的细胞[31]。生长因子通过调节细胞增殖、细胞活性、趋化性和细胞分化促进牙周膜内某些细胞的生长和分化[32]。从理论上讲，生长因子通过激活和分化所需的细胞类型，可以使牙周组织再生。生长因子是一种内源性信号分子，可调节细胞在机体修复过程中的迁移、增殖和分化。但是其存在稳定性差、体内半衰期短等缺点[33]。如何使生长因子持续、高效释放以促进种子细胞定向分化和维持细胞表型是当前面临的关键性问题之一[34]。Nakahara T[35]等以胶原海绵支架和含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的明胶微球组成的夹心膜作为缓释系统植入到比格犬双侧牙槽骨缺损处，研究表明：明胶微球作为bFGF 载体起着重要的作用。在其植入后4 周内维持稳定的bFGF的释放，牙周组织内有大量毛细血管增生和新生骨形成。

3.展望

明胶微球含有许多化学官能团，包括羧基、硫醇、羟基和氨基，对生长因子和细胞因子具有较高的负载能力。除蛋白质外，GMs 还能包封小分子药物，如万古霉素、多索红霉素和双氯芬酸钠。由于其优异的生物相容性、低毒和大剂量的承载能力，已显示出作为化学药物和基因运载载体的潜在应用前景;另外多孔明胶微球密度低，比表面面积大，吸收性能好，在组织再生支架的研制中有着广泛的应用前景[36]。虽然制备具有预定义孔隙率的明胶微球仍有很大的挑战性[37]。但随着明胶微球制备方法的不断改进和创新，其在口腔医学领域具有广泛的应用前景。