发作性睡病1型的免疫学研究进展

徐 涛， 吴惠涓， 赵忠新

发作性睡病是一类以日间过度思睡、猝倒发作和夜间睡眠障碍为主要特征的慢性睡眠障碍，可伴有体重增加，入睡前幻觉和心理障碍等临床表现[1]。根据国际睡眠障碍第三版(ICSD-3)的分类，发作性睡病被分为两型[1]：1型，伴猝倒发作，患者脑脊液中下丘脑分泌素-1(Hypocretin-1，Hcrt-1)水平有明显下降；2型，不伴猝倒发作，脑脊液中Hcrt-1水平无明显下降。人类外侧下丘脑有大约70000个生产Hcrt-1的神经元，此类神经元在1型发作性睡病患者脑内有90%～95%已缺失[2]。研究显示，Hcrt-1是脑内重要的维持觉醒的递质，其缺失是导致1型发作性睡病的主要病理因素[3]。因此，探究下丘脑Hypocretin能神经元损伤或凋亡的机制是明确发作性睡病病因的关键。

发作性睡病以散发病例为主，家族聚集性低[4]。据统计，患者一级亲属的发病风险虽是正常人群的20～40倍，但发病率仅为1%～2%；即使同卵双胞胎的共患率也只有25%～30%。这些证据表明，发作性睡病的遗传并非决定因素，后天获得性的影响更为重要。长期以来，自身免疫因素被认为是特异性Hypocretin能神经元损伤的主要原因[5]，基于此类学说，我们从基因多态性、感染与疫苗、体液免疫、细胞免疫以及应激损伤五个方面，对1型发作性睡病的免疫学机制进展进行概述。

1 基因多态性研究

1.1 HLA关联性研究 从上世纪末起，发作性睡病与人类白细胞抗原(HLA)的关联性就已被广泛探究，其中HLA-DQB1*06：02和DQA1*01：02两基因座的出现频率与发病密切相关[5，6]。研究表明，98%的1型发作性睡病患者携带有HLA-DQB1*06：02，而它在正常人群中的携带率只有12%～38%[6]，HLA-DQB1*06：02可与HLA-DQA1*01：02共同编码主要组织相容性复合体Ⅱ型(MHC-Ⅱ)DQαβ异二聚体(DQ0602)[7]。这类异二聚体可表达于抗原呈递细胞表面并提呈抗原肽供TCR识别。如果某个体的两条等位基因均表达DQ0602，则发病风险将会增加2～3倍[8]。

进一步研究提示多种编码MHC-Ⅱ类分子的基因均与发病相关，但影响程度较小，如HLA-DQB1*03：01可让发病风险提升1.5倍[9]，在亚洲人群中，它可将发病年龄提前2岁[10]。保护性基因型的有大量报道，等位基因上DQ1族(包含DQA1*01，DQB1*05，DQB1*06) 基因座的存在则会降低风险，相关机制被称为“等位基因竞争”[10]。HLA基因区域的一些单核苷酸多态性(SNP)也与发病相关，其中SNP rs7744293与DQB1*06：02紧密连锁，位于HLA-DP区域的 SNP rs3117242的存在则会让发病风险提升2.45倍[11]。

1.2非HLA基因相关性研究

近年来全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)观察到大量非HLA基因与发作性睡病的相关性。研究发现T细胞受体(TCR)α基因座J区域片段的某些特定变异可以显著提升患发作性睡病的风险，其中rs1154155是可能性最高的一个SNP。多数TCR由α和β链构成，其中α链由DNA的TCR基因座上V，J区域的基因片段重组并表达形成并赋予TCR高度的多样性[12]。某些类型的TCR对特定MHC分子(如DQ*0602)可能存在特异性识别并激活免疫反应。

其他相关的基因包括P2RY11，rs2305795A被认为是基因中与发病密切相关的一个SNP。P2RY11基因编码一类在CD8+T细胞上表达水平很高的ATP-G蛋白偶联受体，参与调节淋巴细胞的成熟、趋化和凋亡。2017年的一项研究报道P2RY11基因变异的患者体内找到的变异位点，可能与CD8+T细胞的功能失调有关[13]。与P2RY11基因同在一段保守序列上的还有PPAN，EIF3G和DNMT1 基因，EIF3G 基因内的SNPrs3826784也与本病相关，该基因在真核细胞蛋白质翻译过程中有重要作用[14]。一些免疫芯片研究发现[15]，NT1患者组织蛋白酶H (Cathepsin H，CTSH)和肿瘤坏死因子超家族成员4(TNFSF4，也被称作 OX40L)，广泛表达于抗原呈递细胞内，在抗原呈递过程中有重要作用，能够促进T细胞增殖。

近期，围绕趋化因子受体1、3(CCR1、CCR3)基因的研究发现，CCR3基因敲除小鼠的日间睡眠片段化，当腹腔内被注射脂多糖后，小鼠日间觉醒时间延长而NREM睡眠时长缩短，尸检发现这批小鼠外侧下丘脑的Hypocretin能神经元数目下降，提示CCR3基因在睡眠-觉醒的调节及发作性睡病的发病机制中的重要角色[16]。而CCR1基因内的一个SNP rs3181077被发现可增加发病风险，携带该突变基因的患者体内CCR1 mRNA水平下降，且单核细胞迁移指数也有所降低[17]。

2 感染与疫苗

2.1 H1N1感染 2009～2010年甲型H1N1流感大流行与发作性睡病的发生密切相关。据报道，2010年流感结束后中国华北与华东地区发作性睡病的发病率是以往的3～4倍[18，19]，但与中国疫苗接种未显示明显相关性。随后的实验研究显示：患者体内分离出可被HCRT56-58和HCRT87-99激活的CD4+T细胞中部分亚群可被pHA1 275-287显著激活，后者作为甲流病毒HA抗原片段与HCRT56-58和HCRT87-99具有序列上的相似性[20]，提示流感病毒抗原模拟自身抗原产生交叉反应的可能。此外，研究发现当缺少T细胞和B细胞的小鼠(重组激活基因1缺陷小鼠)感染H1N1病毒后出现发作性睡病样睡眠结构改变，解剖显示病毒主要侵犯脑干和下丘脑区域，其中就包含Hypocretin能神经元，提示流感病毒直接损伤神经元的可能[21]。

2.2 疫苗 流感结束后，芬兰和瑞典国内报道在接种名为Pandemrix的流感疫苗后，5～19岁的青少年发作性睡病发病风险增加了6～9倍[22]。Pandemrix不同之处来自AS03佐剂(角鲨烯和α-生育酚组合)而它含有α-生育酚这类促进免疫细胞迁移、细胞因子分泌、抗原呈递的物质，并通过一种被称作“旁观者激活”的假说引起免疫系统广泛激活。Masoudi等还发现α-生育酚会促进Hypocretin分泌，过量的Hypocretin可能会诱发APC对Hypocretin片段提取和呈递[23]，该实验结论更倾向于发病机制为T细胞的特异性识别。

2.3 链球菌 A组溶血性链球菌感染与发作性睡病也有关联。链球菌抗原与人类自身抗原的相似性因风湿病而广为人知，但既往链球菌感染还会使发作性睡病的发病风险提升5倍。实验报道患者体内链球菌特异抗体如抗“O”抗体的阳性率为65%，而正常人群中只有26%[24]。化脓性链球菌超抗原(Streptococcus pyogenessuperantigens，SAgs)，可以与TCR结合并激活多种类型的T细胞[25]。链球菌的感染还会诱导T细胞分泌IL-17，并提高血脑屏障的通透性[25]，潜在增加了Hypocretin能神经元暴露于免疫系统的风险。

3 体液免疫

尽管多数研究倾向于发作性睡病1型由体液免疫途径介导，但始终缺乏特异性自身抗原抗体存在的证据。2010年，一种名为同源性Tribbles2(TRIB2)蛋白自身抗体被发现更多地存在于患者体内(与正常人相比14%∶5%)[26]。TRIB2广泛表达于中枢神经系统乃至免疫细胞内。将含有TRIB2自身抗体的IgG注射到裸鼠的脑室内，使其产生了发作性睡病样表现，病理显示裸鼠的大脑内Hypocretin能神经元、神经元特异性核蛋白和突触素均发生丢失，提示TRIB2自身抗体不只作用于Hypocretin能神经元[27]。但目前多个研究均未发现1型发作性睡病患者的体内存在任何指向Hypocretin能神经元的自身抗体[28]或Hypocretin前体及其片段敏感的IgG[29]；多项针对已知自身抗体的筛查如anti-Ma2(参与诱发边缘性脑炎)，NMDAR(N-methyl-D-aspartate receptor)和CASPR2(contactin-associated protein2)抗体均未有阳性发现[29～31]。神经节苷脂(GM)是流感血凝素的结合位点，在一项筛查发现患者脑内11种GM自身抗体的血清学检测显示抗GM3抗体阳性率(14.6%)显著高于正常对照(3.5%)，且抗GM3抗体与HLA-DQB1*06：02之间有紧密关联(P=0.016)[32]。这类研究表明，自身抗体通常阳性率低且特异性不足，其产生有两种可能性：由神经元损伤所导致的继发性免疫反应产生，或疾病未发生之前早已存在。

数项研究针对体液的细胞因子含量进行检测以确定患者体内免疫反应的强弱。Michel等对比44例发作性睡病患者与57例其他类型睡眠增多患者的脑脊液细胞因子含量，仅有CCL3水平(趋化因子配体3)具有显著差异(发作性睡病患者体内水平更高)，而血清IFN-γ浓度则在患者发病初期显著升高。IFN-γ水平的上升可以反映免疫活动的增强，而CCL3单因子的改变缺乏显著意义[33]。Dauvilliers等的研究则发现患者脑脊液中仅有IL-4含量相比正常个体显著上升[34]，另一项对9例患者和9例正常对照的研究则未发现任何显著的脑脊液细胞因子水平差异[35]。而重复的血清检验则发现相对于DQ*0602阳性正常对照，发作性睡病患者外周T细胞活化程度和TNF、IL-2等细胞因子分泌量显著上升[36]。然而，上述研究结论差异较大，体液细胞因子水平与发病机制的联系尚不明确，考虑到睡眠节律的改变也会作用于免疫系统，相关改变是因是果仍需进一步探究。

4 细胞免疫

在外侧下丘脑，生产黑色素浓集激素(Melanin-Concentrating Hormone，MCH)神经元与Hypocretin能神经元混合分布，但患者体内MCH神经元未受损伤[2]。由于中枢缺乏自身抗体与炎症浸润存在的证据，CD8+T细胞参与Hypocretin能神经元特异性损伤成为另一种可能。

中枢神经系统的免疫耐受性来自于血脑屏障的阻隔以及神经元中MHC的低水平表达。但T细胞仍可通过第5腰椎和脉络丛进入颅内。一项针对西尼罗河病毒性脑炎的实验发现病毒侵入后受感染的神经元迅速分泌CXCL10，并招募大量表达CXCR3的CD8+T细胞进入中枢[37]。Sasaki等的一项试验用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为抗原使小鼠建立免疫应答，之后GFAP特异性CD8+T细胞会终身自发进入中枢并停留在脑膜与血管周围，分泌少量炎性细胞因子并引发间歇性的自身免疫反应[38]。

有趣的是，制作发作性睡病小鼠模型的方法模拟了可能的发病机制，这类转基因小鼠脑内Hypocretin能神经元能够表达流感病毒HA抗原蛋白，在注射HLA抗原特异性CD8+T细胞后小鼠很快出现Hypocretin能神经元特异性丧失和发作性睡病样症状，然而当改为注射CD4+T细胞时则无类似改变，提示CD8+T细胞介导的特异性神经元损伤的可能性[39]。

上述细胞免疫参与发作性睡病的可能机制仍然需要证据证实。值得注意的是，从H1N1的感染到发作性睡病起病常需几个月，提示慢性免疫进程且相关免疫细胞可能只占很少一部分，因此针对发病初期患者的筛查仍难以发现免疫细胞和炎症因子改变的证据。

5 组胺与内质网应激

2013年，一项针对发作性睡病患者的大脑尸检显示组胺能神经元的数量平均增加了64%[40]。研究发现组胺与脑室内皮细胞的结合可以提升血脑屏障的通透性，从而促进T细胞进入中枢[41]。组胺也可以促进小胶质细胞释放一氧化氮并通过诱导内质网应激来损伤Hypocretin能神经元而一氧化氮对邻近的MCH神经元影响很小，从而解释了Hypocretin能神经元的特异性损伤[42]。组胺能神经元与自身免疫因素导致的Hypocretin能神经元损伤的相关性也被提出[43]。事实上，Hypocretin能神经元相对于MCH神经元更易受损伤，兴奋性毒素如喹啉酸的作用可以通过NMDA 受体的异常激活显著减少小鼠Hypocretin能神经元数量，而相同环境下的MCH神经元数量无明显下降[44]。目前临床证据显示发作性睡病患者的脑脊液组胺水平低于或组胺通路信号传递受阻[45，46]。组胺参与发作性睡病的发生机制作为一类新观点亟需进一步试验加以明确。

6 结 语

在1型发作性睡病的免疫机制中，基因和环境因素从不同角度施加影响，导致脑内特异性Hypocretin能神经元的损毁，但仍有许多重要问题亟待研究明确。目前已发现众多易感基因和环境诱发因素的存在，但考虑到相对较低的发病率，哪项因素才是发病的关键？小胶质细胞在发病进程占据怎样的地位，尚无相关实验报道。炎症因子、自身抗体水平是否因为患病时间的延长而逐渐下降，以至于无法检测？未来对流感患者或发作性睡病患者发病超早期，甚至临床不典型期进行特异性抗体检测和中枢的细胞免疫相关检测，可能对发病机制的研究有所突破。此外，对发作性睡病机制的探究也将有助于高危人群的识别与预防，对核心免疫通路的理解将为治疗开创新路。