细胞周期检测点激酶与肿瘤的关系研究进展

郭爱叶，李 泮，高 岚

(河南省人民医院检验科，河南 郑州 450003)

人体每天都会有大量的DNA损伤，导致DNA损伤的原因主要是细胞内DNA受到如紫外线、活性氧、化学试剂和电离辐射等外界因素或机体内源性DNA复制时的应激反应的影响，导致DNA的化学结构或编码特性出现异常，进而引起基因组改变[1-2]。这种损伤若不能及时修复，就会对机体造成严重的健康威胁，甚至会导致肿瘤的发生。常见的2种细胞周期检测点激酶(checkpoint kniase，Chk)是Chk1和Chk2，两者在DNA损伤修复过程中发挥着极其重要的作用，其缺失或过度表达都有可能引起一些肿瘤的发生、发展，影响肿瘤患者的预后。随着Chk1和Chk2成为国内外研究的热点，Chk及其与肿瘤关系的研究也有了很大的进展，本文就近年来的研究进展进行综述如下。

1 Chk概述

1.1 Chk基本结构和功能Chk主要包括Chk1和Chk2，均属蛋白激酶，具有相似的化学结构和重合的底物谱[3]，但是在不同的肿瘤组织中这2种激酶却有着不同的表达。

1.1.1 Chk1基本结构和功能 Chk1最初在裂殖酵母菌中被发现，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一员，相对分子质量约54 000[4]。人类Chk1基因在染色体11q24上被发现，其cDNA长度为1 891 bp左右，目前主要有7种转录变异体。Chk1蛋白由476个氨基酸组成，主要包括一个可催化底物磷酸化的N-末端激酶结构域和一个可接受磷酸化调节的C-末端抑制性结构域[5]。

Chk1是一种在进化上具有高度保守性的蛋白激酶，主要在细胞核内发挥作用，在人和多种动物的细胞质和细胞核中都能发现其存在。Zachos等[6]的研究发现，正常表达的Chk1基本不会影响体细胞的正常生长，但是当Chk1受到外界或内部因素的影响发生基因突变或表达异常时，可能会导致细胞凋亡和DNA复制不完全，影响DNA的损伤修复，甚至可能由于Chk1表达异常，子代细胞携带不完全的基因并躲过了细胞自身的检查，继续增殖发育形成恶性增殖的细胞，最终导致肿瘤的发生。

Chk1能够影响染色质的结构稳定、调节细胞周期和胚胎发生，细胞内纺锤体和染色体的装配过程也与Chk1有关。此外，Chk1蛋白激酶还能直接影响细胞的凋亡和DNA的修复，调节细胞的热休克反应和细胞对蛋白质错误折叠、人类免疫缺陷病毒感染等的应激反应[7-9]。

1.1.2 Chk2基本结构和功能 Chk2是一种多功能蛋白激酶，属于丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白，相对分子质量约60 000，人类Chk2基因在染色体22q12.1上被发现，cDNA全长约2 061 bp，目前主要有8种转录变异体。Chk2蛋白由543个氨基酸组成，主要包括3个区域，分别为氨基酸对富含区、叉头相关结构域和近C末端的蛋白激酶结构域。

Chk2在正常组织细胞中广泛存在，在细胞周期的各个阶段都发现了Chk2蛋白激酶，并且Chk2蛋白激酶具有显著的组织特异性。与Chk1一样，Chk2也能够调节细胞周期，从而参与到DNA损伤修复过程中，维持染色体的稳定。有研究[10]表明，在正常生长期间，Chk2通常在细胞核内以无活性单体的形式存在，在没有DNA损伤时，Chk2可以将乳腺癌易感性基因1(BRCA1)磷酸化，这有利于保持染色体的稳定性和有丝分裂纺锤体组装的正确性。当外界一些因素导致DNA损伤断裂时，Chk2通过ATM依赖途径中苏氨酸68的磷酸化被激活[11-12]。

1.2 Chk与DNA的损伤反应DNA损伤反应是指当DNA大面积损伤并且不容易修复时，损伤感应器能触发更为广泛的反应，使细胞免受高水平DNA的持续损害，细胞内信号通路被激活，传递损伤信号到各种效应蛋白。当细胞DNA损伤发生时细胞周期检测点被激活，阻滞细胞周期并进行DNA的修复以及修复后的细胞周期重启，主要涉及到四种蛋白激酶：Chk1、Chk2、毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)和ATM/Rad3相关蛋白(TAR)[13-14]。

1.2.1 Chk1与DNA损伤修复 在分子水平上，ATR-Chk1途径能识别出包括离子辐射、DNA复制压力、DNA单链的断裂、病毒感染和DSB末端切除等多种DNA损伤[15]。在应对离子辐射或复制压力引起的DNA损伤时，最主要的通路是TAR-Chk1-细胞分裂周期因子25(cell division cycle protein 25，Cdc25)通路，在此通路中，ATM和ATR作为DNA损伤应答反应中的重要感受器，能把DNA受损信号通过中介因子准确快速传递至Chk1，Chk1被激活后将DNA复制起始因子Cdc25磷酸化，使Cdc25加速泛素化降解，最终引起细胞周期停滞，为DNA损伤修复提供时间。Lu等[16]发现ATM也可以通过磷酸化Chk1的Ser317位点激活整个通路发挥DNA损伤修复作用。不仅如此，在双链DNA断裂反应中，Chk1激酶通过磷酸化TLK的Ser695位点参与到DNA的复制和损伤修复过程中[17]。

1.2.2 Chk2与DNA损伤修复 Chk2通过负调控机制在细胞周期的调控中发挥作用，当DNA受损尤其是DNA双链断裂时，可通过ATM-Chk2-Cdc25信号通路激活相应检查点阻滞细胞周期进程，进行DNA损伤修复。在人类细胞中，Chk2通过特异性磷酸化BRCA1的Ser988位点使BRCA1从细胞核移动到细胞质中，即改变BRCA1的核定位，被活化的BRCA1再参与到同源重组DNA修复通路中，同时抑制非同源末端连接。当DNA损伤由于某些原因无法被有效修复时，Chk2会通过P53依赖型和P53非依赖型2种途径诱导含有受损DNA的细胞发生细胞凋亡，从而清除这些细胞[18]。

2 Chk与肿瘤

2.1 Chk1与肿瘤Chk1是重要的细胞周期检测点的调节蛋白之一，其稳定表达有利于DNA损伤修复机制的正常进行，有助于维持基因组的完整和稳定[19]。当Chk1基因失活或表达异常时，DNA损伤修复不能正常进行，导致DNA损伤由于不断进行复制而增加积累，这就使某些本应该生理性凋亡或正常生长增殖的细胞不断进入细胞周期，最终形成恶性增殖的细胞，甚至导致肿瘤的发生[20]。有研究[9,21-24]发现，在正常细胞中Chk1蛋白激酶的表达较低，但是在人类肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌和结肠癌等肿瘤细胞中有较高的表达，这提示Chk1蛋白激酶的高表达可能与这些肿瘤的发生密切相关。卫茹等[25]在对Chk1和Rad51蛋白在食管胃结合部腺癌组织中的表达及意义的研究中发现，Chk1蛋白的表达水平越高，患者的预后越差，2种蛋白具有协同促进肿瘤发生、发展的作用。

Chk1蛋白激酶能够介导细胞DNA的损伤修复，对于正常的细胞来说这的确降低了由DNA突变引起的细胞恶性增殖的风险，但对于肿瘤细胞来说，Chk1蛋白激酶同样也能修复由抗肿瘤药物引起的DNA损伤，这令肿瘤细胞降低了对DNA损伤剂的敏感性，削弱了放、化疗的疗效。许多研究也间接证实了这一说法。学者们发现Chk1表达缺失的肿瘤细胞通常会表现出对DNA损伤剂的敏感性增加、细胞周期检测点的阻滞作用消失和细胞增殖缓慢等缺陷[26-27]，而Chk1高表达的肿瘤细胞相较于Chk1低表达的肿瘤细胞在严酷的肿瘤微环境或DNA损伤的情况下有更强的适应能力。目前也有证据表明，Chk1基因缺失可能与乳腺癌相关基因及细胞的恶性生物学行为有关[28]。

2.2 Chk2与肿瘤目前多数学者认为Chk2基因属于抑癌基因，人类肺癌、卵巢癌等许多肿瘤细胞中Chk1蛋白水平有较高表达，与Chk1不同的是，Chk2激酶蛋白在许多肿瘤组织中表现为表达缺失，这影响了细胞周期的停滞或受损DNA的修复，可能导致无法阻滞突变的基因复制，并使肿瘤易感性提高，经过长时间的异常基因的积累可能会导致肿瘤的发生、发展。王一然等[29]在对Chk2基因突变与乳腺癌的关系研究中发现，Chk2基因是乳腺癌重要的易感基因之一。Jiang等[30]也在对乳腺癌的研究中发现Chk2基因座丢失。殷子然[31]在对25例卵巢癌患者的研究中发现，Chk2蛋白的异常表达可能与卵巢癌的形成密切相关。这说明Chk2的表达缺失与多种肿瘤的发生密切相关。但是，在另一些研究中发现Chk2在某些原发性食管癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤中却表现为高表达，促进肿瘤的发生、发展，这使得Chk2可能属于抑癌基因的结论受到挑战[32-33]。

3 Chk抑制剂与肿瘤治疗

3.1 Chk1抑制剂与肿瘤治疗Chk1蛋白激酶抑制剂根据其作用机制可分为ATP竞争性抑制剂和非ATP竞争性抑制剂，如AZD7762是一种有效的ATP竞争性抑制剂，在肿瘤细胞DNA损伤时，其可以阻滞细胞周期停滞和DNA修复，引起细胞凋亡。根据其化学结构的不同可将Chk1蛋白激酶抑制剂分为7类：喹啉酮类、脲类、吡咯并咔唑酮类、苗并吡唑类、吲哚类、含硫化合物和一些其他类型[34]。Chk1蛋白激酶抑制剂在临床上的应用主要作为敏化剂，与一些放、化疗药物联合使用，通过抑制Chk1蛋白激酶的功能来增加肿瘤细胞对放、化疗药物的敏感性，增强放、化疗的疗效。

Chk1蛋白激酶抑制剂还可以与其他一些药物联合使用通过产生“合成致死”效应来杀死肿瘤细胞，不仅如此，目前已有许多Chk1抑制剂单药抗肿瘤的研究报道[35]，其中LY2606368已进入多种肿瘤治疗Ⅱ期临床试验阶段，有待进入Ⅲ期临床试验。由于第1代Chk1蛋白激酶抑制剂给药途径具有争议，而且细胞毒性较强，所以其在临床上的试验被终止。

3.2 Chk2抑制剂与肿瘤治疗与Chk1类似，Chk2蛋白激酶也能够修复损伤的DNA，而Chk2蛋白激酶抑制剂则能够抑制Chk2的表达，减弱Chk2对DNA损伤的肿瘤细胞的修复，增加肿瘤细胞对DNA损伤剂的敏感性，因此，Chk2蛋白激酶抑制剂可以与放、化疗药物联合使用以增加放、化疗对肿瘤细胞的损伤，不仅如此，其还能保护正常细胞，减弱放、化疗对正常细胞的损伤。有研究[36]发现，Chk2抑制剂使具有P53缺陷的肿瘤细胞对基因毒性剂生物敏感性更强，这是由于同时缺少Chk2和P53会使G1/S、G2/M检查点失效。主要的Chk2抑制剂包括VRX0466617、AZD 7762、AB C3742、PV1019、NCS10955、CCT241533、XL9844等[37]。其中AZD7762、NSC109555、小分子抑制剂C3742等已经进入Ⅰ期临床研究。值得一提的是，有学者指出，多数Chk2蛋白抑制剂不具有特异性，通常对Chk1蛋白激酶也有活性，这非但不能增加抗肿瘤药物的效果，反而表现出对放、化疗的抵抗作用[5]。

4 小结与展望

近年来，对Chk的研究取得了一定的进展，许多研究都表明，Chk1和Chk2是最常见的Chk，在细胞周期检测机制中也发挥着十分重要的作用，两者的基因或蛋白表达的异常可能会导致肿瘤的发生。90%已知肿瘤的组织中能够同时检测到Chk1和Chk2，但这2种蛋白激酶在不同肿瘤组织中表达情况并不完全相同，而且两者是否与肿瘤的发生、发展有关也尚无定论。由于Chk1抑制剂的特异性要优于Chk2抑制剂，所以大量学者更倾向于对Chk1蛋白激酶抑制剂的研究。Chk1抑制剂和Chk2抑制剂都能够起到提高肿瘤细胞对放、化疗药物的敏感性的作用，因此Chk与放、化疗联合应用于肿瘤的治疗已成为近年来的研究热点。但Chk抑制剂应用于临床之前还要进行大量的研究。