胰腺癌分子分型的研究进展

孙晨 蒋慧 郑建明

海军军医大学附属长海医院病理科，上海 200433

【提要】 胰腺导管腺癌(PDAC)是世界上恶性程度最高的肿瘤之一，近年来发病率逐步升高，但其生存率并未有明显提高。PDAC表现为显著的异质性，而这为其分子分型提供了依据。随着二代测序技术的发展，PDAC的DNA、RNA、蛋白质等的突变模式也越来越清楚。本文旨在总结近年来PDAC的分子分型的研究进展。

胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是恶性程度最高的肿瘤之一，预后极差，5年生存率<10%[1]。手术切除辅以化疗是唯一的治愈性方案，然而只有15%～20%的患者在诊断时可以进行手术并且即使在成功切除后，预期的5年生存率也<20%[2]。1999年，美国国家癌症研究所提出通过分子分析技术，以肿瘤的分子特征为依据进行分类，首次提出了肿瘤分型这个概念。而后二代测序技术提供了肿瘤DNA、RNA、蛋白质和表观遗传等突变资料，这些资料增加了对肿瘤异质性的理解，也为肿瘤分类提供了新方法[3]。胰腺癌分子分型的提出对靶向疗法、预后评估、个体化治疗的发展起到了至关重要的作用，本文旨在对近年来国际上提出的胰腺癌分子分型进行综述。

一、以基因和染色体突变为基础的分型

早期研究证明，在PDAC中最常见的突变基因是KRAS、SMAD4、TP53以及CDKN2A/B，后通过大量基因测序、相对基因组杂交等技术，ARID1A、GATA6、SF3B1以及TGFBR2等基因的突变也陆续被发现[4-6]。Shindo等[7]对854例PDAC患者进行了分析，发现有3.9%的患者发生了生殖系突变，而其中最常见的突变基因是BRCA1/2、PALB2、CDKN2A、TP53、MLH1、ATM。

Waddell等[8]通过对100例PDAC样本进行全基因组测序和拷贝数变异分析，以染色体结构改变和涉及的分子机制为基础将其分为4种亚型，分别为：(1)稳定型(20%)。肿瘤基因组有<50个结构突变事件，表现出广泛的非整倍性，提示在细胞周期或有丝分裂中存在缺陷。其KRAS和SMAD4的点突变率与其他亚型相似，TP53突变率略低于样本的平均水平(61%比70%)。另外同其他亚型相比，该亚型的端粒的长度无明显不同。(2)局部重排型(30%)。其在一条或两条染色体上表现出明显的局部结构改变，表现为局部基因的扩增或放大和复杂基因的重排。大约有1/3的局部重排型的基因组包含着原癌基因拷贝数目的增加如KRAS、SOX、GATA6的局部扩增，有时会包括靶向基因如ERBB2、MET、CDK6、PIK3CA及PIK3R3，但发生率很低。剩余2/3的局部重排型存在着复杂的基因组事件，例如断裂-融合-桥或染色体碎裂形成环状染色体。(3)分散型(36%)。表现出中等程度的非随机染色体损伤，以及<200个结构改变事件。(4)不稳定型(14%)。肿瘤表现出大量的染色体结构改变事件(>200个，最多达558个)，这体现了DNA维护的缺陷，提示这种亚型对DNA损伤药物的敏感性较高。

二、以基因表达为基础的分子分型

Collisson等[9]在2011年首次对PDAC进行了分型。其通过对27个显微切割的手术样本进行分析，将PDAC分为3种亚型：经典型、类间充质型、外分泌型。(1)经典型：其黏附相关基因和上皮细胞相关基因的表达增高，且癌细胞内GATA6及KRAS mRNA含量较高，预后较其他两型好。(2)类间充质型：间充质相关基因(TWIST1、HK2、CAV1)表达增多，对吉西他滨更敏感，但预后最差。(3)外分泌型：通过免疫组织化学染色，可发现肿瘤细胞来源的消化酶基因表达增高。但他们认为外分泌型可能是被肿瘤周围正常组织污染所致。随后Janky等[10]通过对118例PDAC和13例正常胰腺组织标本进行分析表明，两者间共有6 873个基因的表达存在差异，而其中有1 325个基因在PDAC中下调。其中肝细胞核因子1同源框A/B(hepatocyte nuclear factor 1 homeobox A/B，HNF1A/B)下调程度最强，其在分化较好的PDAC中表达较低，而在分化较差的PDAC中不表达。该研究同样证明，经典型的预后最好。但与Collisson等的结果不同的是，他们发现外分泌型和类间充质型的预后相似。

Moffitt等[11]通过对145例原发性PDAC、61例转移性PDAC、17个细胞系、46个胰腺和88个远端部位相邻的正常样本进行基因芯片测序，对肿瘤的实质和间质分别进行了分型：(1)肿瘤实质细胞分为经典型和基底细胞样型，并认为这是独立的预后因子。基底细胞样型中层粘连蛋白和角蛋白基因表达增高，这与先前在胆囊癌[12-14]和乳腺癌[15]中描述的一致。基底细胞样型的预后较经典型差，其中位生存时间短(11个月比19个月)，生存率低(44%比70%)。(2)间质分为激活型间质和正常型间质。在正常型间质中，胰腺星状细胞的标志物如平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和结蛋白表达相对增高。激活型间质的特征是存在一系列与巨噬细胞相关的基因如整合素ITGAM以及趋化因子配体CCL13/18的表达。激活型间质中表达促进肿瘤发展的相关基因，包括分泌蛋白SPARC、WNT家族成员WNT2和WNT5A、明胶酶B和间充质溶解素3。由于成纤维细胞活化蛋白的出现已被证明与较差预后有关[16]，因此认为激活型间质的预后较正常型间质较差。另外间质和实质的预后效应是叠加性的，经典型肿瘤+正常型间质的危害性最低(HR=0.39)，而基底细胞样型+激活型间质的危害性最高(HR=2.28)。

Bailey等[17]以转录因子及其下游靶点的表达差异为基础将PDAC分为4种亚型，分别为鳞状型、胰腺祖细胞型、免疫型和内外分泌分化异常型(aberrantly-differentiated endocrine exocrine, ADEX)。(1)鳞状型：TP53和KDM6A突变率较高，与炎症反应、缺氧反应、代谢重编程、TGF-β信号转导、MYC途径激活、自噬和TP63delN及其靶基因的上调表达的基因相关。(2)胰腺祖细胞型：主要表达参与胰腺早期发育的基因(如PDX1、MNX1、HNF4G HNF4A、HNF1B、HNF1A、FOXA2、FOXA3和HES1)。特征是具有和内胚层细胞命运相关的基因与无融合蛋白的共表达。(3)ADEX型：主要表达参与胰腺发育和分化的后期阶段的基因(NR5A2、MIST1、RBPJL、INS、NEUROD1和MAFA)。(4)免疫型：其特征是存在与T和B细胞信号通路相关的免疫浸润及Toll样受体信号通路，预后极差。而Collisson分类中的类间充质型、经典型和外分泌型可分别被鳞状型、胰腺祖细胞型和ADEX型所取代，其基因表达和临床病理有着共同特征[11,16]。

最近癌症基因组图谱联盟重现了二元经典型、基底细胞样型分类，并显示ADEX亚型和免疫型是由于取材时样本被瘤周正常组织污染所致。同时鳞状型、类间充质型、基底细胞样型有着相同的特征；经典型、胰腺祖细胞型有着相同的特征[18]。

三、以肿瘤细胞和肿瘤微环境的特征为基础的分子分型

肿瘤微环境对患者的预后有显著的影响。Puleo等[19]对309例PDAC样本进行了基因表达、靶向DNA测序和免疫组织化学分析，根据肿瘤细胞和肿瘤微环境的特征将其分为5种亚型。(1)完全经典型：其间质特征不明显，细胞浸润水平较低，KRAS突变和Gly12Arg较丰富。(2)免疫经典型：间质特征尤其是结构血管化和免疫间质较明显，存在低蛋白酶体或凋亡信号，伴随着NK、T、B细胞等免疫细胞的浸润，且KRAS突变和Gly12Arg较丰富。(3)完全基底细胞样：由基底样细胞组成，间质信号较低。Gly12Val是主要的突变类型，有MET和Hedgehog通路的激活，与转移扩散显著相关。(4)间质激活型：间质中存在大量α平滑肌肌动蛋白，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、成纤维细胞活化蛋白等激活型间质的成分。有MET和Hedgehog通路的激活，伴随着大量的成纤维细胞和内皮细胞浸润且其炎症成分较多。(5)结缔组织增生型：存在着低肿瘤成分和大量间质转录组信号，包括免疫和炎性间质组分特别是结构和血管化间质组分的高表达，伴随着大量免疫细胞、内皮细胞及成纤维细胞的浸润。不同的是，间质对预后的影响取决于肿瘤实质的亚型。对于经典型肿瘤来说，间质对预后产生负性影响；而对于基底细胞样型肿瘤来说则是正性影响。预后最差的是完全基底细胞样型，其存活时间中位数为10.3个月；完全经典型为43.1个月，免疫经典型为37.4个月；间质激活型的预后较完全基底型稍好。

四、以miRNA表达为基础的分子分型

miRNA是一类非编码的、17～25 bp的短RNA分子，在转录后水平调节基因表达[20-21]。其可以通过结合mRNA3`非编码区导致基因的降解或抑制翻译来控制基因表达水平[22-23]。其失调涉及到肿瘤的发生、发展及转移，因此miRNA可以作为新型的诊断、预后和治疗标志物[24-27]。到目前为止，已有多种miRNA被证明和胰腺癌的预后相关。miR-142-5p和miR-320c可预测肿瘤对吉西他滨的反应[28-29]。据报道，miR-200c、miR-142-5p和miR-204的高表达与切除后更好的存活率相关，而miR-155、miR-203、miR-210、miR-222、miR-21和miR-196a-2的高表达与切除后的不良预后相关[30-32]。Namkung等[33]通过对104例胰腺PDAC样本进行基因芯片分析得到了1 733种miRNA的表达图谱。根据miRNA表达水平的不同，其将PDAC分为高风险、中等风险、低风险3种与预后相关的亚型。3种亚型的中位生存时间分别是17.2、26.5、32.4个月。又因为低风险型和中等风险型的miRNA基因表达谱相似度较高，所以将其归为一组，与高风险型相比较，其分类标志为19个miRNA分子(miR-106b-star、miR-324-3p、miR-943、miR-1292、miR-4474-5p、miR-935、miR-668、miR-574-5p、miR-1244、miR-4763-5p、miR-145-star、miR-328、miR-26b-star、miR-615-5p、miR-1914-star、miR-564、miR-3194-5p、miR-4746-3p、miR-4321)。 在高风险组中，miR-574-5p、miR-1244和miR-4474-5p表达上调；而其他16个miRNA则下调。在效应程度方面，miRNA-54-5p和miR3-243-3p的效应最强。这19种miRNA中的6种(miR-574-5p、miR-1244、miR-145-star、miR-328、miR-26b-star和miR-4321)与总体生存率和无病生存率显著相关[33]。

五、以免疫反应为基础的分子分型

Wartenberg等[34]根据微环境的免疫细胞组成将PDAC分为3种亚型。(1)免疫逃逸型(54%)：其微环境中CD3、CD4、CD8型T细胞和CD20B细胞较少，但FOXP3+Treg细胞较多；存在局灶性p63表达且KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4及PIK3CA的突变率较高。形态学上肿瘤出芽程度较高，临床病理特征不良。以上特征与预后较差(中位生存期10个月)相关。(2)免疫丰富型(35%)：在微环境中有大量的CD3、CD4、CD8型T细胞和CD20型B细胞，但FOXP3+Treg细胞少。其出芽程度较低，临床病理特征较好。与免疫逃逸型相比，CDKN2A、SMAD4和PIK3CA突变率较低。在研究队列中，很少有GNAS和IDH2突变。这些特征使其预后较好(中位生存期19个月)。(3)免疫枯竭型：有两种亚群，而这两种亚群在微环境特点上有很大相似点。第一种有PD-L1高表达，肿瘤出芽程度较高，PIK3CA突变率较大，伴随着CD8/FOXP3比值高以及较差的预后(中位生存时间为10个月)；第二种为微卫星不稳定亚群，其DNA错配修复蛋白缺失，有着最高的CD8/FOX3比值，高JAK3/PIK3CA突变率的抗肿瘤微环境，伴随着透明质酸介导的运动受体表达的肿瘤芽[34]。

目前胰腺癌的分子分型还没有一个统一的标准，分型方法也不尽完善，某些亚型之间存在交叉重合性。应综合众多分子分型方法的优点，总结各种胰腺癌亚群的异同，朝着形成统一的分子分型方法的方向努力。相信随着分子诊断技术的不断进步，会使胰腺癌的临床分类诊断、个体化治疗、反应预测、预后评估达到新的高度。

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