靶向Toll样受体4 治疗支气管哮喘的价值

王 楠 王 曦 高 蕾 陈 子 周林福,2,3

支气管哮喘(哮喘)是多基因参与的具有遗传易感性的慢性气道炎症性疾病，其发病涉及多种炎症细胞、炎症介质和复杂的细胞因子网络，以血清IgE增高、气道炎症、气道高反应性和气道重塑为显著的临床特征[1]。Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)是果蝇受体Toll同源物，作为固有免疫系统的一种重要的模式识别受体，连接着机体固有免疫和适应性免疫。目前已鉴定人类14种TLR。越来越多的证据表明，TLR在炎症性和免疫性疾病中扮演着重要的角色[2-4]。其中，TLR4与哮喘的发生发展密切相关[5-6]。靶向TLR4及其信号通路，为治疗哮喘提供了新的思路。本文将就TLR4信号转导通路、TLR4与哮喘发病机制、靶向TLR4治疗哮喘的研究进展做一综述。

一、 TLR4结构及其信号转导

自从TLR在人类首次被识别[7]，加上新近发现的TLR13[8]，目前在哺乳动物中已鉴定了14种TLR。其中，TLR4为I型跨膜糖蛋白，包括胞外区、跨膜区、胞内区3个部分。胞外区由16～28个亮氨酸重复序列组成，识别外源性病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)以及内源性损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)。胞内区是结构相对保守的Toll/IL-1受体(TIR)结构域，负责起始胞内信号转导[9]。

革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)为TLR4 的天然配体。结晶学分析显示，LPS结合TLR4-髓样分化蛋白2(myeloid differentiation 2, MD2)异源二聚体，导致“M”型TLR4-MD2-LPS受体多聚体形成，该多聚体由两个结构对称的TLR4-MD2-LPS复合物组成。 LPS位于MD-2组成的疏水性口袋内，连接受体多聚体的两个部分。在LPS 6条脂质链中，5条链埋在MD2组成的疏水性口袋内，只有一条链暴露在MD2表面，与TLR4的苯丙氨酸疏水区相结合[10]。LPS与TLR4结合导致受体复合物二聚化，使两个TLR4的TIR 结构域结合更加紧密，进而导致受体复合物结构改变并募集下游接头蛋白。

当接头蛋白髓细胞样分化标志88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)激活，可依次募集IL-1R 相关蛋白激酶4(IRAK4)、IRAK1、IRAK2 和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体相关因子 6(TRAF6)。TRAF6激活转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)活化的蛋白激酶1(TAK1)、TAK2 和TAK3 复合物，继而活化核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)抑制物(IκB)激酶复合物(IKK复合物)，IKK复合物则催化IκB蛋白磷酸化降解。于是，NF-κB核转录信号暴露并发生核移位，启动IL-6、IL-12 p40 或TNF等多种炎症基因转录。TRAF6还可以通过激活丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和干扰素调节因子5(interferon regulatory factor 5, IRF5)促进炎症应答。这就是TLR4的 MyD88依赖途径。另外，TLR4还可以通过含诱导干扰素β(interferon-β, INF-β)接头蛋白的TIR 域(TRIF)依赖途径，通过TRIF相关接头蛋白分子(TRAM)，最终导致IRF3和NF-κB的活化及核转录。IRF3核转录启动Ⅰ型干扰素基因表达[11]。

除了识别外源性微生物表面PAMP，TLR4还能识别内源性危险信号分子，包括高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1, HMGB1)、热休克蛋白(heat shock protein, HSP)、S100蛋白等[12-13]。其中，HMGB1与哮喘尤其是重症哮喘的关系最为密切[14]。HMGB1可经TLR4和/或晚期糖基化终产物受体(the receptor for advanced glycation end products, RAGE)，促进细胞外基质合成，参与人支气管上皮细胞的损伤修复[15]。哮喘小鼠肺组织HMGB1、TLR4和NF-κB的表达显著高于对照组，并与气道壁厚度呈正相关，这表明HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路可能参与哮喘气道重塑。另外，HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路还可能与哮喘气道炎症的形成有关[16]。

二、TLR4在哮喘发病机制中的作用

哮喘是一种异质性气道变应性疾病，表现为多变的临床表型和复杂的基因型。哮喘发病不仅涉及宿主遗传易感性，还与免疫紊乱(如Th2优势免疫)以及环境暴露等因素有关。基因-免疫-环境交互作用，促进了哮喘的发生发展。

1. TLR4连接卫生假说和过敏进程: 哮喘流行病学揭示了两个备受瞩目的经典现象，包括卫生假说(hygiene hypothesis)和过敏进程(atopic march)。卫生假说认为，随着个人卫生提高，家庭设施改善，家庭规模下降，过敏症(变态反应)发病率反而显著增高，比如花粉症、湿疹和哮喘[17]。据此推测，儿童早期感染或有裨益，并有助于降低成年哮喘等过敏症的发病率。其实，通过接触病原微生物或影响共生菌群，或两者兼而有之，皆可促进免疫系统早期成熟，增强Th1免疫，从而调节Th1/Th2失衡。皮肤过敏原致敏时，一旦TLR激活(TLR4结合配体LPS或TLR2结合配体Pam3Cys)，即可上调保护性Th1免疫，有利于阻遏哮喘发展[18]。而且，罹患过敏症儿童的单核细胞对LPS的反应性受损[19]，这说明TLR4及其信号通路与卫生假说现象密切相关。

若在生命早期患有特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)，随后易于罹患其他过敏症，譬如过敏性鼻炎和哮喘，称为过敏进程[20]。这说明哮喘的致病途径可能始于皮肤，继而累及气道，并印证皮肤屏障的完整性在防治哮喘中至关重要。业已证明，TLR4在角质形成细胞中表达，并参与皮肤抗微生物感染及损伤修复[21-22]。或许，TLR4参与早期调节固有免疫系统，同时在启动和促进过敏进程中发挥作用。由此可见，卫生假说具有保护作用，可能缘于机体把过敏原视为微生物来源。若外源性微生物和/或机体自身共生菌群在固有免疫系统发育早期减少，过敏原则失去TLR微生物配体(如LPS、Pam3Cys)作为共刺激分子。因此，反复过敏原刺激将不断加剧Th2免疫，甚至引起更为严重的过敏症，即过敏进程[18, 23]。

2. TLR4介导过敏性哮喘： 作为固有免疫系统中结构和生物学特性剖析最透彻的模式识别受体，TLR4与哮喘发病密切相关。尘螨、蟑螂、花粉、真菌是哮喘常见的过敏原。在屋尘螨(house dust mite, HDM)中，LPS以TLR4依赖方式引起过敏性哮喘，而β葡聚糖则以TLR2依赖方式激活鼻黏膜固有免疫并导致过敏性鼻炎。显然，鼻部和肺部存在不同的免疫应答形式[24]。造血细胞TLR4的表达，可参与过敏原和吸入性LPS所致的中性粒细胞反应，而气道上皮细胞TLR4的表达则参与吸入过敏原介导的嗜酸性粒细胞反应。这证明不同细胞表达的TLR4对吸入过敏原产生的免疫应答具有不同调控作用[25]。而且，LPS剂量的高低会影响哮喘组织学类型。其中，低剂量LPS暴露时，卵蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的哮喘小鼠肺组织呈嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润为主，气道黏液呈高分泌，表现为Th2优势免疫。中高剂量 LPS暴露时，OVA哮喘小鼠反而出现中性粒细胞浸润为主，气道黏液呈高分泌，并诱导Th1免疫应答。

有趣的是，富含LPS的OVA可引起Th1、Th2混合型免疫应答，而不含LPS的OVA只能引起Th2优势免疫[26]。而且，低剂量LPS刺激的中性粒细胞可诱导人外周血嗜酸性粒细胞跨基底膜迁移，参与重症哮喘的发生发展[27]。HDM通过诱导气道上皮细胞而非免疫细胞TLR4活化，即可释放天然细胞因子如IL-25、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)并致敏，促进形成哮喘Th2优势免疫[28]。树突状细胞(dendritic cell, DC)依赖FcRγ、TLR4和磷脂酰肌醇3激酶(phospholipid polymyo-inositol 3 kinase, PI3K)诱导Th2优势免疫，其中上调IL-33是主要机制之一[29]。

TLR2、TLR3和TLR4活化在过敏原经皮肤致敏产生过敏性哮喘中发挥调控作用。表皮微生物经皮致敏后，通过LPS、Pam3Cys分别活化TLR4、TLR2，可降低或消除过敏性哮喘，并且LPS、Pam3Cys上调真皮DC细胞表面协同刺激分子CD80和CD86，促进DC活化并导致更多的 CD8+T细胞产生，支气管肺泡灌洗液(BALF)IFN-γ水平增加，引起免疫应答向Th1型偏移[18]。而且，空气源性微生物产物暴露对过敏性哮喘尚有抑制作用。实际上，该免疫调节既不促进Th1免疫应答，也不依赖于调节性T细胞(Treg)和分泌IL-10，而是依赖于TLR4并且不涉及TLR脱敏。DC向引流淋巴结迁移及T细胞活化并未受影响，只是肺部活化的DC减少且抗原呈递能力受损。因此，原位Th2细胞因子产生减少。并且，γδ T细胞也介导了对气道高反应性的抑制作用[30]。另外，TLR4信号通路既参与OVA诱导的过敏性气道疾病，又调节肺炎链球菌介导的对其抑制作用[31]。

TLR4还可协同其他受体，在哮喘急性加重中发挥作用。TLR3配体poly (I:C)和LPS 联合作用，可使哮喘小鼠气道高反应性显著增加。这与临床上微生物感染引起哮喘急性加重相一致[32]。混合性过敏原HDM激活气道上皮细胞释放HMGB1，随后依次激活TLR4、RAGE，继而放大变态反应[33]。

3. TLR4基因多态性与哮喘临床表型和严重程度： 在TLR4及其信号通路中，信号转导分子的基因多态性不仅影响到哮喘发生，而且与哮喘患者的临床特征相关[34]。研究发现，在CD14、TLR4、IRF3、TRAF6、TIRAP、TRIF、IKK-1、ST-2和SOCS1 九个基因中，有21个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，并对LPS暴露时体外IgE的合成起调节作用。TLR4相关基因多态性与哮喘患者临床征象相具有对应性，例如，症状性气道高反应性(CD 14 rs2915863和rs2569191，TRIF rs4807000)，哮鸣音(ST-2 rs17639215，IKK-1 rs2230804 和TRIF rs4807000)，以及特应性(CD14 rs2915863和rs2569192，TRAF6 rs5030411，和IKK-1 rs2230804)[35]。就CD14 159而言，C等位基因和T等位基因分别与低水平、高水平血清总IgE有关。C等位基因还是中度和重度哮喘的危险因素。但是，TLR4 299 和399 基因型与哮喘表型之间无显著的相关性[36]。不过，TLR4基因多态性还可能影响哮喘的严重程度[37]。

诚然，TLR4活化对过敏性哮喘的调节作用取决于接触配体的数量、TLR4的亚细胞定位、过敏原的给药途径和方式以及TLR4与其他受体之间的协同作用等。此外，TLR4及其信号通路中信号转导分子的基因多态性、个体的种族、性别、生活环境、社会经济地位和病理生理状态等，也与哮喘密切相关。一系列炎症细胞和细胞因子网络参与了哮喘的发生发展，包括中性粒细胞、气道上皮细胞、TSLP和丝聚蛋白等。

三、靶向TLR4及其信号通路治疗哮喘的价值

TLR4在哮喘Th2优势免疫、基因型和临床表型中起重要作用。TLR4活化是一个涉及多分子交互作用的复杂过程，包括LPS、CD14、MD-2、LPS结合蛋白(LPS-binding protein. LBP)以及MyD88 和TRIF等接头蛋白。TLR4信号通路为哮喘免疫治疗提供了多个潜在的治疗靶点。

1. 抗LPS多肽： 合成的抗LPS多肽可与LPS结合，竞争性抑制LPS结合蛋白或其他哺乳动物蛋白与LPS相结合，从而阻止TLR4复合物激活，并抑制LPS诱导的细胞因子分泌[38]。而且， 通过中和细菌LPS，能够抑制人巨噬细胞产生TNF-α[39]。

2. TLR4拮抗剂： 随着TLR4-MD2-LPS复合物胞外晶体结构被解密，应用虚拟筛选方法识别新型TLR4小分子拮抗剂的潜力大幅提高[10]。合成的LPS类似物Eritoran(E5564)可结合MD-2，防止LPS激活TLR4，有益于治疗炎症性疾病[40]。 Eritoran拮抗TLR4，缘于其无法像LPS一样导致MD-2分子中F126位的5å转移[10]。LipidIva是天然的TLR4拮抗剂，通过与LPS竞争结合MD-2，抑制人TLR4信号[41]。VIPER为来自痘苗病毒蛋白A46的新型肽抑制剂，可阻断TIR-TIR结构域之间的交互作用，抑制TLR4依赖的信号通路[42]。 NovImmun NI0101 (NovImmune)是TLR4拮抗性抗体，能够阻止受体二聚化。人源化TLR4单克隆抗体Hu 15C1通过结合FcγRI以及TLR4，使抗体的活性显著增强[43]。据报道，人源化抗TLR4单抗Fab段能够阻断小鼠腹腔巨噬细胞TLR4信号转导通路，从而有效逆转LPS诱导的炎症反应[44]。晚近，全人源抗人TLR4 抗体的真核表达载体被成功构建，获得全分子抗 TLR4 IgG 抗体。而且，该重组全人源抗 TLR4 IgG 抗体与 TLR4 呈特异性结合，并具有显著的中和作用，彰显其对炎症性疾病具有潜在的应用价值[45]。

3. 微小RNA(miRNA)： 自从发现了miRNA对免疫防御相关基因的调控作用，靶向气道的miRNA有望成为哮喘抗炎治疗的新策略。miR-487b通过抑制IL-33转录可负向调节骨髓源性巨噬细胞的活性，从而降低LPS诱导的促炎因子的产生[46]。miR-146靶向TLR信号转导蛋白TRAF6和IRAK1，负向调节TRAF6和IRAK1 mRNA的水平[47]。miR-155靶向含有Src同源性2(SH2)结构域的肌醇5磷酸酶1(Src homology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1, SHIP-1)，后者可负向调节NF-κB信号[48]。另外，调节TLR4信号通路的激酶(尤其是 IRAK4)活性、蛋白磷酸化和泛素化修饰以及阻断凋亡抑制剂的活性，均为抗哮喘新药研发提供了新思路。

4. 抗HMGB1抗体： 研究表明，重组HMGB1可激活DC并产生IL-23，活化的DC则促进初始T淋巴细胞(Th0细胞)产生Th17细胞因子IL-17A[49]。抗HMGB1中和抗体可抑制中性粒细胞性哮喘小鼠模型肺组织HMGB1表达、气道炎症和气道高反应性。重组HMGB1 A盒(HMGB1拮抗剂)通过抑制DC介导的Th17细胞极化，能够缓解中性粒细胞性气道炎症和气道高反应性[50]。

5. 抗炎单体： 查尔酮衍生物L2H21是一种新型MD2抑制剂，可抑制LPS诱导的急性肺损伤(ALI)[51]。HMGB1和TLR4在LPS诱导的ALI大鼠肺组织显著上调，且两者呈显著正相关。氯胺酮能抑制ALI大鼠HMGB1和TLR4的表达，并减轻LPS诱导的ALI[52]。黄豆苷元可显著抑制ALI大鼠肺组织巨噬细胞和中性粒细胞浸润，降低BALF炎症因子水平，抑制TLR4和MyD88蛋白表达以及NF-κB激活[53]。鱼腥草素钠可抑制香烟烟雾和LPS联合诱导的大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型肺的炎症，并与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关[54]。

TLR4的生物学功能取决于其在体内分布的广泛性及其信号通路的复杂性。TLR4不仅参与哮喘等免疫性疾病的发生发展，而且涉及炎症、肿瘤和感染性疾病的病理生理。作为固有免疫的模式识别受体，TLR4是机体防御外来微生物侵犯的第一道防线，并且位于信号转导的上游。靶向TLR4可有效阻止下游复杂的信号转导，有望成为治疗过敏性哮喘乃至中性粒细胞性炎症性疾病(包括重症哮喘、COPD、ALI等)的潜在靶点[55]。TLR4将过敏进程与卫生假说联系起来。关于遗传易感个体(譬如，某些丝聚蛋白等位基因携带者，或有严重过敏症家族史的儿童)缘何易于对各种环境过敏原产生免疫应答亟待阐明[23]。深入剖析TLR4、MD2、LPS交互作用的独特结构以及TLR4二聚化的分子机制，有望为研发有效的TLR4抑制剂提供依据。TLR4缺陷型基因工程小鼠的建立以及人源化抗TLR4单抗的成功构建，不仅为今后免疫治疗哮喘提供了新的技术平台，而且，在基因和表观遗传水平上进一步诠释哮喘异质性的本质，无疑也为开发哮喘靶向治疗药物带来了新的愿景。