猪δ冠状病毒的病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，杨丽梅，李 峰

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，滨州 256600）

猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是近年来新发现的一种能够引起猪只严重水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪死亡的猪肠道冠状病毒。其临床症状及病理变化与猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等均非常相似，临床上很难区分，若不加以预防和控制，将会给养猪业造成重大损失。因此，加强该病毒的研究与防控，建立快速有效的病毒检测技术非常关键。本文对PDCoV的发现、病原学特征、培养特性及检测技术研究进展等方面进行了综述，以期为更好地诊断和防控本病提供参考。

1 病毒的由来和发现

PDCoV最早于2012年由中国香港的研究人员在鉴定哺乳动物与禽类的新冠状病毒时被首次发现。2014年在美国腹泻仔猪和母猪的粪便中首次被成功检测并分离到，随后陆续在加拿大、韩国、中国大陆和泰国等国家被检出[1]。Dong等（2015）[2]对2013—2014年间采自我国湖北、江苏、广东、河南、安徽等省市规模化猪场的258份粪便样品进行检测，共检测到21份阳性样品，阳性率为14.3%，首次证实PDCoV在我国猪场中存在。

2 病毒的分类地位

PDCoV属于冠状病毒科δ冠状病毒属成员。冠状病毒科分为α、β、γ以及δ冠状病毒属共4个属。α和β冠状病毒属主要由哺乳动物冠状病毒组成，γ冠状病毒属主要包括鸟类冠状病毒，而δ冠状病毒属既包括哺乳动物冠状病毒，也含有鸟类冠状病毒[3]。PEDV和TGEV均属于α冠状病毒属。δ冠状病毒属最初只在禽类体内发现。

3 病毒的病原学特征

3.1 病毒的形态特征

PDCoV病毒粒子结构与其他冠状病毒相似，呈典型的冠状病毒形态。电镜观察显示，PDCoV病毒粒子呈球形，直径约为120～180 nm，具有囊膜、纤突。

3.2 病毒的基因组结构及功能

PDCoV为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组结构与PEDV相似，全长约为25.4 kb，是目前已知冠状病毒家族中基因组长度最小的病毒。PDCoV具有5′端帽子结构和3′端Poly（A）尾巴。共编码 4种结构蛋白，即纤突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和4种非结构蛋白[1]。N蛋白是冠状病毒中一种多功能磷酸化的结构蛋白，是冠状病毒在感染细胞中产生最多的病毒蛋白之一，结构具有保守性和种属特异性。利用冠状病毒N蛋白这一特性，可用于建立高效、准确、快速的分子生物学检测技术。S蛋白是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点。E蛋白较小，是负责病毒与包膜结合的蛋白。M蛋白负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成。

3.3 病毒的培养特性

Hu等（2015）[4]对PDCoV分离及细胞适应性进行了较为详细的研究发现，PDCoV可以在猪睾丸细胞（ST）和猪肾小管上皮细胞（LLC-PK）上生长与传代，并产生明显的细胞病变（CPE），表现为细胞变圆、聚集，最后脱落。在病毒分离和培养过程中，需要添加胰酶、胰液素或未感染仔猪的小肠内容物（SIC）。若培养基不加胰酶处理，病毒在LLC-PK细胞上仍能复制生长，但不会产生CPE，而且病毒滴度也比较低。其认为胰酶或SIC是病毒培养过程中非常重要的因素，可能通过影响病毒与受体结合、病毒进入细胞或者复制的某个阶段，从而促进病毒的复制以及CPE的产生。这表明PDCoV与PEDV在病毒入侵细胞以及病毒复制过程中有相似的机制。

4 病毒的流行病学与致病性

PDCoV是猪的一种肠道疾病病原，病毒感染仔猪后尽管出现腹泻和脱水，但其食欲一般不受影响，且体温保持正常。PDCoV主要感染部位在小肠上皮细胞，剖检可见小肠上皮损伤和肠绒毛脱落等病变，这与PEDV、TGEV感染仔猪后的剖检变化极为相似。

5 病毒检测技术研究进展

5.1 病毒的分离培养

目前对于PDCoV的分离培养，主要采用LLCPK和ST细胞。国内陈建飞等（2016）[5]将黑龙江某

收稿日期：2017-11-17

基金项目：山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）

作者简介：庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，副研究员，硕士，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制.E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com猪场的PDCoV阳性样品无菌处理后接种LLC-PK细胞并连续传代培养，成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株。M基因的系统发育分析表明，NH株与中国、美国及韩国的PDCoV亲源关系较近。

5.2 血清学检测技术

5.2.1 ELISA（酶联免疫吸附试验） Ma等（2015）[6]以PDCoV全病毒作为包被抗原建立了间接ELISA方法。Thachil等（2015）[7]建立了以原核表达纯化的PDCoV S蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。通过对已知的210份血清样本进行PDCoV抗体检测，得出该方法的敏感性和特异性分别为90.6%和94.8%。对355份血清样品进行检测，阳性率为8.7%。国内张帆帆等（2016）[8]、苏明俊（2017）[9]、逄凤娇等（2017）[10]先后建立了以原核表达的PDCoV N蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法，并应用建立的方法进行了大量血清学检测，表明我国不同地区猪群中都存在PDCoV感染，为PDCoV的流行病学调查及防控提供了重要依据。

5.2.2 其他血清学方法 Chen等（2015）[11]、Hu等（2015）[4]、Okda 等（2016）[12]先后应用间接免疫荧光法（IFA）在PDCoV病毒分离过程中检测培养细胞中病毒的存在。Chen 等（2015）[11]以兔抗 PDCoV M、N和S蛋白抗体作为一抗建立了PDCoV组织免疫化学分析法（IHC），并利用该方法分析了PDCoV感染猪的组织，结果显示PDCoV主要集中在空肠中段、末端及回肠部位，说明PDCoV对此部位较为敏感，为PDCoV的临床诊断、组织分布以及致病机理研究奠定了基础。Jung等（2015）[13]建立的原位杂交（ISH）和免疫荧光染色法，对PDCoV感染猪后在组织中的复制位点进行了测定，结果显示PDCoV在猪的整个肠道引起急性感染，但病毒最先在空肠和回肠部位进行复制。Okda等（2016）[12]采用建立的ELISA和荧光微球免疫检测法（FMIA）方法对PDCoV感染猪的血清抗体动力学进行了初步研究，实验室感染条件下，两种方法的检测结果均表明PDCoV血清抗体转换发生在感染后8～14 d。

5.3 分子生物学检测技术

5.3.1 RT-PCR技术 目前已建立的PDCoV特异性RT-PCR，都是针对M基因或N基因保守区域的。在PDCoV流行初期，Wang等（2014）[14]根据香港株PDCoV HKU15-155的M基因和N基因为靶基因设计特异性引物建立了RT-PCR方法，首次确定了PDCoV在美国的出现。Sinha等（2015）[15]采用RT-PCR对来自美国18个州的1 734份样本的检测结果证明至少在2013年8月就已经存在PDCoV。逄凤娇等（2016）[16]根据PDCoV M基因建立的RT-PCR方法，最低检测限达 6.33×104拷贝/μL。郑丽等（2017）[17]根据PDCoV M基因建立了RT-PCR方法，对110份临床样品进行检测，阳性检出率为11.8%。张帆帆等（2016）[18]根据PDCoV N基因建立RT-PCR方法，最低能检测到1.0×103拷贝/μL。陈建飞等（2016）根据PDCoV E蛋白和M蛋白基因设计引物建立了RT-PCR方法，对2014年1月至2015年11月收集的77个猪场的232份临床腹泻样品进行了RT-PCR 检测，PDCoV 阳性率达 10.34%（24/232）。Song等（2015）[19]以 PDCoV N基因为靶基因建立了巢式RT-PCR方法，应用该法对2012年11月至2015年3月在江西采集的356份猪粪便或肠道样本进行检测发现，PDCoV阳性样品高达33.71%，PDCoV与PEDV共同感染率为19.66%。由于PDCoV与PEDV引起的临床症状极为相似，在普通实验室很难进行准确的诊断，因此建立一种针对两种病毒的诊断方法是非常必要的。Zhang等（2016）[20]在传统RT-PCR基础上以PDCoV和PEDV的M基因作为靶基因建立了一种针对PDCoV和PEDV的双重RT-PCR。其中对PEDV的检测限为7个RNA拷贝，对PDCoV的检测限为14个RNA拷贝。刘玲玲等（2016）[21]根据PDCoV N基因和TGEV N基因序列设计引物建立了能同时检测PDCoV和TGEV的双重RT-PCR方法。用建立的该双重RT-PCR方法对252份临床样品进行检测，检出PDCoV阳性样品31份，阳性率为12.30%，TGEV阳性样品12份，阳性率为4.76%，同时感染PDCoV和TGEV的阳性样品2份，阳性率为 0.79%。韩丽等（2017）[22]根据 PDCoV N基因和PEDV M基因序列设计引物，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR方法。用建立的该双重RT-PCR方法对111份临床样品进行检测，其中PDCoV阳性样品22份，阳性率为19.82%，PEDV阳性样品27份，阳性率为24.32%，PDCoV和PEDV共感染的样品数为10份，阳性率为9.01%。任玉鹏等（2016）[23]建立了同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立，应用该法对222份腹泻样品的检测结果表明，PEDV阳性检出率为52.2%、PDCoV为2.7%、TGEV为2.3%。双重或多重RT-PCR方法能够快速、准确地对PDCoV、PEDV和TGEV等单一或混合感染的临床样品进行快速检测，为临床上对猪病毒性腹泻鉴别诊断和流行病学调查研究提供了新的技术手段。

5.3.2 荧光定量RT-PCR技术 实时荧光定量RT-PCR比常规RT-PCR具有更高的优势，在PDCoV的检测方面也取得了进展。Marthaler等（2014）[24]针对PDCoV的ORF1、S1和M基因设计引物并建立了TaqMan荧光定量RT-PCR方法，结果表明M基因引物的灵敏度高且稳定性好。Chen等（2015）[11]、Zhang等（2016）[20]也先后针对PDCoV的M基因建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。张利卫等（2017）[25]根据PDCoV M基因序列设计引物，建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。应用该法对临床198份临床腹泻样品进行检测，阳性率为 20.71%（41/198）。Ma等（2015）[6]、肖帅等（2017）[26]先后根据PDCoV N基因设计引物，建立了PDCoV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。荧光定量RT-PCR方法，能在猪发病早期或病毒隐性感染时进行确诊和实时监测，不仅可以应用于PDCoV的流行病学调查，也将为PDCoV的定量检测和快速诊断提供有力的技术手段。

6 小结

PDCoV的传播给世界养猪业带来了严重的经济损失，引起了人们的关注。目前尚无针对PDCoV的商品化疫苗、特效治疗药物和防治方法，人们对PDCoV的认识也比较匮乏，与其他引起腹泻的病毒相比，PDCoV的诊断和检测工具尚处于发展阶段，但随着人们对PDCoV研究的不断深入，尤其是对其致病机制和免疫机理的深入了解，相信在不久的将来，PDCoV的疫苗和更加简便、有效的检测技术都会相继面世，以用于控制该病的发生与流行。