5-羟色胺在肺动脉高压中作用机制的研究进展

王玉秀 徐兴祥 迟焙元 龚道辉 闵凌峰

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH) 是以肺动脉阻力的进行性升高为特点，导致患者右心后负荷的增加，最终因右心衰竭而死亡的一种极度恶性的进行性疾病。其主要病理特征主要表现为：肺小动脉的血管痉挛、肺动脉内膜的增生以及血管重构[1-2]。 2014年指南指出PAH 的定义是指静息状态下右心导管测定的平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)≥25 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，或运动后mPAP>30 mmHg[3]。研究显示平滑肌细胞表型的改变以及过度增殖在肺血管重构以及肺动脉高压的发生中起着重要作用。在低氧等诱导刺激下，肺动脉平滑肌细胞由收缩表型向合成表型转化，导致平滑肌细胞的增生、肥大，并从肺动脉的中膜迁移至其内膜，通过一系列信号转导系统启动或诱发肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的增殖[4]。参与肺动脉高压发病的机制复杂多样，众所周知的有血管紧张素、内皮素等相关的机制，但就肺动脉高压发病机制的研究目前仍然存在一定的缺陷[5-7]。研究发现5-羟色胺(5-Hydroxytryp-tamine, 5-HT) 作为一种内源性血管活性物质与呼吸系统疾病如支气管哮喘、阻塞性睡眠呼吸暂停、肺动脉高压等的发生有密切关系[8]。随着肺动脉高压发病率的逐年增高，5-HT 在肺动脉高压中作用机制研究已成为研究热点，一方面5-HT 作为血管活性物质促进肺小动脉的痉挛与收缩，另一方面其作用于肺动脉平滑肌细胞促进肺动脉平滑肌细胞的有丝分裂而促进其增值，进而增加血管阻力促进肺动脉高压的发生。进一步明确5-HT 在肺动脉高压发病机制中的作用将为肺动脉高压预防以及治疗提供新的思路，现就5-HT 在肺动脉高压中的作用以及其作用机制进行综述。

一、5-HT

5-HT是一种内源性的血管活性吲哚胺性物质，主要存在于肠嗜铬细胞组织、大脑和血小板中，是由色氨酸经色氨酸羟化酶转化为5-羟色氨酸，再经5-羟色氨酸脱羧酶脱羧产生5-HT，其主要合成于中枢神经系统以及消化道肠嗜铬细胞，是一种单胺类神经递质，在中枢以及外周均有分布[9-10]。外周5-HT 大部分由肠嗜铬细胞生成，主要分布在胃肠道，另外身体其他部位也有散在的5-HT 分布，其中的大部分都来自于神经脊的胺前体摄取脱羧化细胞(amine precursor uptake decarboxylation, APUD)以及肠肌层神经末梢的肥大细胞[10]。

正常状态下，肺部的5-HT 大多是在血液系统经肝脏代谢后随血液循环到达肺部，并由肺内皮细胞以及血小板摄取，其中更多的则是被血小板摄取并储存于致密颗粒中，另外有研究显示肺内的少部分5-HT 主要来自于肺神经内分泌细胞和沿气道分布的神经表皮小体[9]。5-HT 合成的限速酶色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase, Tph)在肺和肺动脉的平滑肌细胞以及内皮细胞中同样有分布，并且在体外培养的人肺平滑肌细胞以及内皮细胞中可分离出5-HT ，因此肺脏同样也是5-HT 合成的一个场所[11]。5-HT 的合成与降解是一个非常活跃的过程，每24 h就有一个5-HT 被替换，生理状态下，血浆中游离5-HT 的浓度很低，当外界刺激下如低氧时，5-HT 的合成以及分泌会增加，并通过5-羟色胺转运体转运至其靶位置，作用相应5-羟色胺受体，在疾病发生发展中起到一定的作用[12]。

1. 5-羟色胺转运体(5-HTT)： 5-羟色胺转运体(5-Hydroxytryptamine transporter, 5-HTT)是一种膜蛋白，主要作为一种转运蛋白，与γ- 氨基丁酸、去甲肾上腺素转运体蛋白及多巴胺转运蛋白属同一家族，人类5-HTT 是由长约31 kb的14个外显子组成，约含630个氨基酸残基，相对分子质量约为68×103[13]。它的主要功能是终止突出前膜神经递质的释放以及将细胞外的5-HT 转运至细胞内[8]。5-HHT 不仅负责转运神经元5-HT ，同时还负责血小板、内皮细胞以及血管平滑肌细胞对5-HT 的摄取。因此5-HTT 在人体分布广泛，可见于血小板、内皮细胞、血管平滑肌细胞、肥大细胞以及神经系统的突触前膜上，在人气道、消化道以及神经系统等均有分布[13]。 其作用也可想而知，在多种疾病，如糖尿病、冠心病、肺动脉高压等中均表现出一定的作用[14]。

2. 5-羟色胺受体(5-HTR)： 5-羟色胺受体(5- Hydroxytryptamine receptor, 5-HTR)一共有14种，分属于7个家族，其中每一个家族的受体都有自己独特的传导系统，其在结构上存在一定的差异，同时在功能上也表现出不同的作用[15]。另外，每个家族受体又存在不同的亚型，这些亚型在特定的时间和特定的组织进行特异性表达。通常状态下，5-HT 通过靶向作用于5-HTR 而产生一定的作用。目前已证实的有5-HT1B、5-HT2A 和5-HT2B 这三种受体，它们在肺动脉高压的发病机制中发挥一定的作用[16-18]。

二、5-羟色胺在肺动脉高压中的作用

关于5-HT 在肺动脉高压中的作用，首次发现于欧洲20世纪60年代，当时人们发现食用阿米雷司、芬氟拉明及其衍生物等减肥药超过3个月的人较未服用减肥药的普通人群患PAH 的比率要高30倍以上[19]。后经研究证实，这些减肥药物可以促进5-HT 释放，并且抑制5-HT 再摄取及单胺氧化酶对5-HT 的降解，进而提高血浆中游离的5-HT 浓度，这一发现被称为“PAH 的5-HT 假说”[20-22]。5-HT 参与肺动脉高压发生发展的作用机制众说纷纭，研究显示，一方面其作为众多血管活性物质之一，它是强有力的肺血管收缩因子， 5-HT 与5-HTR 的结合增加了磷酸二酯酶活性，进而导致环磷酸腺苷水平下降，引起肺血管收缩, 另一方面，它还可以引起PASMCs 的增殖[23-24]。大鼠动物模型研究显示，香烟烟雾刺激下，不仅会导致大鼠COPD，还会导致其发生PAH，香烟烟雾可能导致血液5-HT以后肺组织5-HTT的表达明显上调，而辛伐他丁可抑制5-HT的表达，减弱香烟烟雾刺激下大鼠COPD以及PAH的变化[8]。另外一项动物实验表明，在野百合(monocrotaline, MCT)诱导的PAH 大鼠模型中，应用5-HT 再摄取抑制剂可降低肺动脉压，并抑制组织炎症反应[25]。这均表明了5-HT 在肺动脉高压发生发展中有重要的作用。

1. 5-羟色胺合成异常在肺动脉高压中的作用： 5-HT 是由色氨酸经色氨酸羟化酶转化为5-羟色氨酸，再经5-羟色氨酸脱羧酶脱羧产生的，其中色氨酸羟化酶(Tph)是5-HT 合成的限速酶。Tph 有两种类型：Tph1和Tph2，Tph2 只分布在脑中[8]。Tph1 主要分布在消化道，它参与调节外周5-HT 的浓度。研究证实：Tph1 在肺组织同样有表达，和肺动脉高压的发生发展存在一定的相关性[24]。原发性肺动脉高压患者肺和肺动脉内皮细胞中Tph1 基因表达明显上调[8, 24]。Ciuclan 等[24]运用动物模型阐述了伊马替尼对肺动脉高压大鼠模型的Tph1 的下调作用，以及其通过血小板源性生长因子受体-β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)信号通路逆转肺动脉高压血管重构、外模纤维化等特点，从而改善PAH 血流动力学以及运动能力的作用。Aiello 等[16]同样用两种PAH动物模型说明了Tph1 抑制剂可减弱肺动脉血管重构。另外，近期一项研究通过肺动脉高压大鼠模型，利用Tph1抑制剂从反方面说明了Tph在肺动脉高压中的作用，研究显示，此种抑制剂以剂量依赖性的明显降低5-HT 以及组胺的表达，并减轻肺动脉高压以及肺血管壁增厚的变化，进一步说明了Tph1 通过调控5-HT 的合成而参与肺动脉高压的发病机制。

2. 5-羟色胺转运体在肺动脉高压中的作用： 5-HTT作为一种转运蛋白，在人体分布广泛，可见于血小板、内皮细胞、血管平滑肌细胞、肥大细胞以及神经系统的突触前膜上，研究显示其表达的异常在多种疾病(包括消化道慢性炎症、老年痴呆以及一些血管性疾病)的发生发展中有很重要的作用。5-HTT 在肺广泛的表达，主要位于肺动脉平滑肌细胞中，在肺动脉高压患者血小板以及肺组织中5-HTT 均有明显的表达增高，在调节肺动脉管壁厚度以及肺血管损伤方面有重要的作用[17]。研究发现肺动脉高压患者5-HTT 的表达明显增高，5-HT 通过5-HTT 内化而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路，促进神经生长相关蛋白(growth-associated protein, GAP)的磷酸化而增加Ras 活性，进一步促进DNA 的合成促进PASMCs 有丝分裂,从而促进其增殖[18]。吸烟在呼吸道疾病的发生中有重要的作用，同样在肺动脉高压发生发展中也有很重要的作用。研究发现吸烟明显增加5-HT 以及5-HTT 的表达，而5-HT以及5-HTT 的表达与WA%、WT% 以及mPAP 相关，表明5-HT 以及5-HTT 的表达也许与肺动脉重构以及肺动脉高压的发生存在明显相关性[8]。近期一项研究表明氟西汀可抑制MCT- 诱导的肺动脉高压模型中的肺动脉以及肺组织5-HTT 的过表达，而5-HTT 的下调可缓解肺动脉高压以及肺血管重构，这更进一步的说明了5-HTT 在5-HT 介导的肺动脉高压的发生中扮演重要的角色[26]。

3. 5-羟色胺受体异常表达在肺动脉高压中的作用： 肺血管中的5-HTR 的异常表达在肺动脉高压的发生发展中同样扮演着重要角色。研究显示，RP5063作为一种5-HRT 调节剂，明显可减轻肺动脉高压血管壁增厚、肺动脉平滑肌增值以及炎性因子的表达[27]。

正常情况下，5-HT 通过5-HT2A 受体调节体循环和肺循环的血管收缩[28]。肺动脉平滑肌细胞的增殖以及肺血管的痉挛是肺动脉重构以及肺动脉高压的中心环节，5-HT2B 受体作为肺动脉高压治疗靶点已经得到很好的证实，一方面5-HT2B 受体还可以调控血浆中5-HT 的水平。另一方面，5-HT2B 受体在肺血管收缩以及肺动脉平滑肌细胞增殖方面都扮演一定的角色[29]。Dumitrascu等[30]研究发现terguride作为5-HT2A/2B 受体拮抗剂，在MCT-诱导的肺动脉高压大鼠模型长期使用可有效预防其血管重构。免疫组化结果显示5-HT2A/2B 主要定位在人类肺动脉血管平滑肌，而定量的PCR 结果显示在肺动脉血管平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)中分离出来的5-HTR2B 的表达明显上调，细胞培养发现人类PASMCs 的增殖和迁移均可被terguride 所阻断。West 等[29]利用5HTR2B 抑制剂SB204741 从反方面进一步证明了5HTR2B 在肺动脉高压中作用机制，其抑制剂可预防骨形态发生蛋白受体2(bone morphogenetic protein receptor 2, BMPR2)突变型小鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖导致的肺动脉高压的发生，同时减轻其肺部炎性反应；减轻其血管壁的肌化，其可防止SRC蛋白的磷酸化以及其下游活动，而预防肺动脉高压的发生。

5-HT1B 受体同样有一定的缩血管反应，但其随着环境和肺动脉部位的变化而不同。在正常环境中，5-HT 主要通过5-HT2A 受体调节肺血管收缩，当机体缺氧时，5-HT1B 受体成为调节肺动脉收缩的主要受体。5-HT1B 是一种G-蛋白偶联受体，其在Ca2+-偶联蛋白介导的增殖效应中起重要作用，另外5-HT1B 和5-HTT 在Ca2+-偶联蛋白介导的PASMCs 增殖有是协同不可或缺的物质。其主要的作用机制是在与5-HT 结合后，可增加磷酸二酯酶活性而导致cGMP 和cAMP 水平下降，引起肺血管收缩，升高肺动脉压力[31]。 另外，5-HT可以诱导细胞Src相关的激酶调节的NOX1诱导的ROS和Nrf-2的失调，促进血管平滑肌细胞蛋白质的转录后氧化修饰，从而促进其有丝分裂反应，而5-HT1B受体在此过程中起关键性的作用，最终导致肺动脉高压的发生[32]。

5-HT 不仅可使肺血管平滑肌细胞DNA 合成促进肺动脉平滑肌细胞的有丝分裂,从而促进肺血管平滑肌细胞的增殖，还可抑制肺血管平滑肌细胞的凋亡，进而在肺动脉高压的发生中起到一定的作用。Hank 等[33]研究显示其可以增加细胞表面cAMP 受体的数目从而抑制肺血管平滑肌细胞的凋亡；5-HT 通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 和磷酸肌醇蛋白激酶(Phosphoinositide-dependent kinase, PDK)信号通路激活5-HT2A 受体与之相互作用，从而抑制肺动脉平滑肌细胞的凋亡[28]。

4. 5-羟色胺在肺动脉高压中作用相关信号通路： 肺动脉高压是一发病机制复杂的慢性疾病，许多血管活性物质通过不同的细胞信号通路，参与肺动脉高压的发病。目前对该病的发病机制研究尚不明确，但在最近几年的研究中，已经发现了一些参与PAH 病变发展的细胞信号通路，如Rho-ROCK 激酶、磷酯酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(Phosphatidyl-3-kinase-Serine/Threonine kinase, P13K-Akt)、ERK等信号通路[34-35]。

(1)Rho-ROCK激酶信号通路： 许多证据表明，活化的小GTP酶 Ras同源基因家族成员A(RhoA)及其下游效应Rho相关激酶(Rho-associated kinase, ROCK)在PAH发病机制中有重要的作用[34]。Rho-ROCK信号通路介导血管持续收缩、细胞的迁移、增殖、凋亡、生存和炎症的过程[36]。Rho-ROCK信号通路已被证明参与多种不同的PAH 实验模型的发病机制，包括野百合碱(monocrotaline, MCT)、慢性缺氧、博莱霉素以及分流诱导的大鼠PAH 模型，以及PAH 患者。在LPA 等诱导的低氧状态下，5-HT 可通过RhoA-ROCK信号通路诱导 th17/treg稳态的失调，在肺动脉高压中扮演一定的角色[37]。在血小板内，RhoA 在谷氨酰胺转移酶2的作用下被共价连接到5-HT 而被激活为RhoA 的5-羟色胺化，在MCT诱导的肺动脉高压模型中，肺内RhoA 的5-羟色胺化以及膜转位显示增加，并且在肺动脉以及肺组织5-HTT、RhoA、ROCK2表达以及ERK和Akt 磷酸化均呈增加，证实了Rho-ROCK信号通路参与MDT诱导的PAH的病理过程，RhoA 的5-羟色胺化明显刺激PASMCs的增殖，并刺激5-HTT的表达增加导致肺动脉血管的重构，在肺动脉高压的发生发展中起重要的作用[26]。

(2)ERK 信号通路： 在低氧等诱导刺激下，胞外5-HT 与细胞膜上的5-HTT 结合，活化蛋白酪氨酸激酶，促使核苷酸交换因子(nucleotide exchange factor)转向质膜，另外ERK 上游因子Ras 蛋白通过异戊烯化修饰后可定位于细胞膜表面，使Ras-GDP 转为有活性的Ras-GTP ，进而激活下游因子Raf ，活化后的Raf 磷酸化并激活下游底物NADPH 氧化酶，使其产生ROS[33]。产生的ROS 通过活化ERK1/2 信号通路，引起转录因子的磷酸化，磷酸化的ERK1/2 核内转移增加，促使转录因子如GATA4、Egr-1、EIK-1与DNA结合而诱导周期蛋白S1004/Mts1 的表达，参与肺动脉平滑肌细胞增殖和肥大[38]。另外，ERK1/2 是5-HT2A 受体的下游作用靶点，5-HT 通过与5-HT2A 相互作用刺激下游ERK1/2 的磷酸化，从而促进平滑肌细胞的收缩。研究表明5-HT通过ERK信号通路调节肺动脉平滑肌细胞的有丝分裂，促进肺动脉平滑肌细胞的增殖[39]。

(3)PI3K-Akt 信号通路： PI3K-Akt 信号通路在肺动脉平滑肌细胞的培养中扮演重要的角色，其同样介导5-HT 引导的肺动脉平滑肌细胞的增殖以及有丝分裂[40]。具体的作用机制还需进一步研究。

三、5-羟色胺相关基因多态性研究进展

肺动脉高压是一复杂的逐渐进展的疾病，有多种影响因素以及细胞信号通路参与肺动脉高压的发生发展，其中遗传因素就是一种主要影响因素，但具体的影响机制尚未得到很好的证实。研究表明，5-HT 在肺动脉高压的发病机制中扮演重要的角色，尤其5-HTT 作为5-HT 内化转运体在肺动脉高压发病机制中有很重要的作用[41]。Johansen 等[42]研究发现过表达的5-HTT 可以调节雌激素的产生，在肺动脉高压中有重要的作用。5-HTT基因位于17号染色体，有14个外显子共计31 kb[43]。研究发现5-HTT 的基因多态性与多种疾病的发生发展相关，包括精神系统疾病(如抑郁症等)、肿瘤、呼吸系统疾病(如COPD、PH等)、肠易激惹综合征等[44-47]。该基因的启动子区域可能有两个变体，一个长(L型)，另一个短(S型)，被看作两种等位基因形式，即插入(L型)或缺失(S型)[12, 48]。研究认为5-HTT 基因多态性与继发性以及原发性的PAH 密切相关，LL 基因型患者明显比SS 基因型患者患PAH 风险高[49]。但Baloira 等[50]研究显示5-HTT 基因等位基因的分布在PAH 患者与正常人中似乎没有不同。不同类型的PAH 有类似的等位基因分布。LL型似乎不表现出临床差异或对治疗反应的差异。5-HT 相关蛋白基因多态是否在5-HT 合成、转运、靶向作用中有一定的作用，还需进一步的研究。另外，肺动脉高压发病机制复杂多样，其中遗传因素在其发生发展中扮演着重要角色，尤其是原发性肺动脉高压，5-HT 在其发病中有重要作用，5-HT相关因子基因多态性是否在肺动脉高压的发生发展中起作用以及其相关的作用机制、信号通路还需进一步研究[12, 51]。

综上所述，5-HT 在肺动脉高压的发生发展中有关键性的作用，对其作用机制的研究也有一定的认知，在目前的临床治疗中，仍存在部分PH患者经过治疗后效果仍然不佳，有些甚至愈后非常差。希望能够寻找出治疗和预防这种致命性疾病的有效方法。因此，进一步探讨5-HT 在PAH 发生发展中的作用机制，以便为发现新的药物治疗靶点，新的治疗策略提供新的方向。