皮质脊髓投射决定触觉和神经病理性触痛的敏感性

为了研究下行的皮质脊髓投射是否调控脊髓水平的感觉信息处理过程，研究者把成年小鼠的双侧锥体束切断，以损伤脑干中的CST来检测他们对伤害性刺激和无害刺激的敏感程度，并通过组织学研究进一步验证。双侧CST损伤（手术切断）造成了小鼠对动态的和静态的轻触刺激的行为反应显著缺失，如对柔软毛刷的轻触刺激反射减少和后爪足底表面胶带实验的反应潜伏期增加。在von Frey测试中，CST损伤小鼠表现为对非伤害性的点状触压刺激(0.16 g)的反应降低，但对能激活伤害感受器的较高机械力(0.6～2.0 g)刺激的敏感性表现为正常；对伤害性热刺激和伤害性机械刺激的后爪缩足反射和一般运动功能也表现为正常。这种在轻触触觉水平的灵敏度选择性缺失，也确证了这样的发现，即CST轴突与外周低阈值敏感的机械感觉传入神经纤维共同终止于脊髓背角的III-V层。

为研究大脑皮层的哪些区域包含可能负责感觉信息调控的CSN，研究者使用了顺行追踪技术来识别脊髓背角的相关神经支配区域。研究发现用来感知后肢初级感觉的大脑皮层(S1)的CST [也有一小部分来自次级感觉皮层(S2)的CST]，他们的神经轴突终止于脊髓背角的III-V层，表明他们具有参与感觉调控功能；而支配后肢运动的皮层更多地向脊髓腹侧投射到VI-VII层，与其已知的参与运动调控的功能一致。 因此，来自皮层S1和S2的CST轴突更可能执行对脊髓水平的触觉信息加工处理过程的控制功能。为了进一步测试此功能，研究者们使用交叉靶标技术在S1/S2的 CSN中表达人白喉毒素受体(DTR)，从而能够选择性杀死（消融）这些神经元。

把表达Cre的高效逆行慢病毒载体(HiRet)在小鼠出生后P14天注射到其脊髓的腰部节段(T13-L6)。之所以选择P14时间点，是因为这时皮质发育的修剪已经完成，接着将AAV-FLEX-DTR载体注射到S1/S2区域，再给予白喉毒素后可选择性杀死约85%的S1/S2的CSN。行为学测试发现这些小鼠完全复制了锥体束切断鼠的行为学表型，表明来自S1/S2皮层的CST轴突在触觉敏感性中发挥一定的作用。

周围神经病理性疼痛的一个突出特征是机械刺激诱发的异常疼痛，表现为轻轻触碰就可诱发疼痛。为了研究CST是否调控机械性异常疼痛，研究者们把给予白喉毒素杀死S1/S2的CSN的小鼠实施了保留性神经损伤(SNI)手术，形成了神经病理性疼痛模型。这些SNI鼠在术后所有的时间点（1～21天），都表现出了由低强度静态von Frey的点刺激引起的异常疼痛和由毛刷刺激引起的动态的异常疼痛的显著减弱；而行锥体束切断术的小鼠却没有形成由SNI或足底注射完全弗氏佐剂（CFA，外周炎性痛的模型）诱发的机械性异常疼痛。但 CST损伤（行锥体束切断术）的SNI鼠仍表现出冷痛敏和对高强度机械刺激所诱发的痛敏。所以研究者们得出以下结论：S1/S2的CSN是诱导机械性异常疼痛所必需的，而不是其他痛敏表型所必需的。为了进一步验证此结论，研究者们运用了可诱导的化学遗传方法瞬时沉默了调控后肢S1/S2中的CSN，发现SNI鼠的机械性异常疼痛显著降低，支持这一结论。以上结果表明，投射到脊髓背角深层的躯体感觉CSN负责在正常条件下对非伤害性触觉信息的加工处理，并参与病理条件下的机械性异常疼痛的形成，这一观点以往也未遭质疑。

为了研究S1中的CSN如何响应外周触觉刺激的，研究者们使用了在体微型显微镜技术来监测表达GCaMP6（一种遗传编码的具有荧光的钙离子指示剂）CSN中的钙离子水平，结果发现正常自由活动鼠S1 中的CSN表现出了稀少的和时间上散在的活性；与此相对应的是，给予后爪毛刷或von Frey刺激而不是激光热刺激，会诱发S1中部分 CSN的钙活动，并且同一小鼠在SNI术后这种钙离子变化显著增加；此外，在SNI鼠对毛刷和von Frey刺激均有反应的神经元比例有所增加。因此，正常鼠的躯体感觉皮层中的CSN可被非伤害性的触觉刺激激活，并且在神经病理性疼痛条件下被进一步放大，表明存在脊髓-皮层-脊髓致敏环路。

那下行的CST轴突是否调控低强度的机械刺激诱发的脊髓神经元的激活呢？研究者们用免疫组化方法在毛刷刺激后的正常鼠和在没有毛刷刺激的SNI鼠的脊髓背角中检测到少有c-Fos表达的神经元；但是给与SNI鼠毛刷刺激可以使同侧脊髓背角所有层面(I-V)中表达c-Fos神经元数量显著增多，切断CST可以反转c-Fos+神经元在深层(III-V)和浅层(I/II)的这种增高，而浅层通常被认为仅处理来自伤害感受器的信息输入并不直接与CST相接触。以上研究表明，CST的信息输入影响了脊髓背角所有层面中毛刷刺激所诱发的神经元激活。位于浅层I中表达神经肽1受体(NK1R)的投射神经元是负责向大脑输入伤害性信息的主要投射神经元，为了研究CSN是否调控这些神经元的激活，研究者们通过监测ERK的磷酸化(pERK)激活作为神经元活性的标记物，结果发现给予SNI鼠触觉刺激能诱导I层中的pERK-NK1R+神经元数量呈CST依赖性的显著性增加，刺激正常鼠则不会发生类似现象。此结果表明在CST完整时，触觉刺激SNI鼠直接激活脊髓背角III-V层中的神经元并间接激活I层中的投射神经元。后一种效应很可能是由于III-V层与I层形成多突触环路连接发生了去抑制作用所导致的。用DTR法消融CST后，通过抑制γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸神经元功能进而阻断了脊髓背角的去抑制作用，能引发机械性异常疼痛。以上研究表明，SNI术后低阈值伤害性纤维的信息传入进而激活上行伤害性感觉通路是需要从CST直接投射到脊髓III-V层环路有信息输入的。与之相一致的研究结果是，触觉刺激SNI鼠后，多个脑区（包括S1/S2中的CSN）的激活可以被DTR法消融CST所阻断。

接下来，研究者们研究了S1/S2 中CST所支配的靶点是脊髓背角中的哪类神经元。兴奋性胆囊收缩素(CCK)iresCre标记的位于背角深层的神经元是由CST和Aβ初级传入神经纤维共同支配的，而CCK+神经元的选择性沉默失活可以导致触觉缺陷，表明CCK+神经元可能是CST支配的靶点。本研究也事实上证明了，选择性消融杀死脊髓腰段(T13-L6)中的CCK+中间神经元后的行为学表型同CST切断的行为学表型相一致：在正常鼠的触觉敏感性中产生选择性缺陷，并在SNI后减轻机械性异常疼痛。 此外，选择性消融杀死CCK+中间神经元，可以显著减少毛刷刺激诱导的SNI鼠脊髓背角全层的c-Fos+神经元数量，但减弱程度低于锥体束切断术鼠，表明由CST和Aβ纤维共同支配的其他神经元也可能参与这一信息的加工处理。这也表明了，脊髓背角深层中的CCK+中间神经元对CST易化触觉敏感性和机械性异常疼痛的贡献更大。

为了测试CCK+中间神经元是否被CST和Aβ纤维直接激活，研究者们用来自CCK-tdTomato转基因鼠、并附着背根的离体脊髓切片进行了全细胞膜片钳记录，CCK-tdTomato鼠S1/S2的CST轴突带有光敏感通道蛋白2，并被黄色荧光蛋白(ChR2-YFP)所标记而便于记录。在被记录的CCK-tdTomato细胞中，有50%表现为对Aβ和CST刺激的兴奋性单突触反应，只有少数是任一输入的单一刺激足以引起动作电位；但在那些与Aβ纤维和CST直接连接的神经元中，共同刺激传入神经纤维和CST下行通路，可以导致超加性突触反应，并带有显著增加的动作电位输出。在荷包牡丹碱（GABAA受体抑制剂）和士的宁（甘氨酸受体抑制剂）存在的情况下（模仿SNI条件下的脊髓去抑制作用），这种增加反应进一步增强，表现为所有记录到的CCK-tdTomato神经元都产生一串连续动作电位。在SNI鼠，重复触摸刺激在脊髓背角诱发的c-Fos+神经元中有一半表达CCK，但在锥体束切除鼠，这些神经元不再表达c-Fos。总之，以上研究结果表明，在正常鼠的CST-CCK+中间神经元环路对触觉输入信息的加工处理过程中起着至关重要的敏化作用，这种作用在神经损伤的条件下（神经病理性疼痛时）是增强的。

最后，研究者们发现在表达ChR2小鼠的S1区的CSN给以光刺激，能显著延长了毛刷轻触刺激诱发的缩足和舔足时间，并显著增加了毛刷轻触刺激诱导的脊髓I层 中NK1R+神经元的pERK表达。由此得出结论，通过CST从躯体感觉皮层到脊髓背角的信息直接输出，有力地强化了触觉信息在脊髓水平的加工处理过程，进而增强了触觉相关信息向大脑的传递。这是一条脊髓-皮质-脊髓前馈敏化环路，该环路在正常状态下对于触觉感觉的加工控制和在神经病理性痛条件下的异常疼痛至关重要。因此，通过药理学或电磁操控方法使已兴奋的躯体感觉CSN回归正常活性，可能是一种治疗神经病理性疼痛的潜在方法。此外，通过发现触觉信息加工处理在脊髓环路水平的直接地被皮层控制的一系列研究结果，在不同的情景状况或情绪状态时，为心理状态通过操控从脊髓到脑的信息传递过程，进而如何直接增强或降低正常状态下和病理条件下的触觉信息加工处理过程，提供了貌似合理的解释。