肠道细菌与非酒精性脂肪性肝病研究进展与现状

池肇春

青岛市市立医院消化内科 (山东 青岛， 266011)

在人类历史的长河中，1.6亿年来人类与定植在胃肠道和身体其他器官内的细菌共生，共同进化，这些细菌数量巨大，达1014以上(人体含有1013真核细胞)，包含约500～1 000个种属。其宏基因大小约为自身基因的100倍[1]。然而直至目前为止仅30%菌种培养成功，70%的细菌尚不能培养。这些庞大的细菌分布全身各组织器官中，其中以胃肠道定植最多。根据其空间分布肠道细菌可分成黏液层细菌和肠腔内细菌，两者在物质交换、信号传递、免疫系统发育和抵抗病原微生物入侵等方面均起到重要作用。在哺乳动物胃肠内定植的细菌主要分属于厚壁菌门(约50%～70%)、拟杆菌门(10%～50%)、放线菌门(1%～10%)、变形杆菌(少于1%)等。肠道细菌不仅可通过调节脂肪吸收和存储相关基因，更重要的是其结构失调导致宿主循环系统中内毒素血症，诱发慢性低水平炎症，导致肥胖和胰岛素抵抗，致使肝细胞脂肪蓄积，促进脂肪肝发生。

人肠道细菌组成受各种因子的影响，如遗传背景、年龄、免疫系统发育、地域、短或长期的饮食方式等均可影响肠道细菌的组成[2～4]。

一般认为细菌-宿主共生需要一个稳定的肠道环境，细菌确保营养的产生与吸收，包括维生素产生和增加营养的生物利用率。最近提出细菌与免疫相关，细菌驱动自身免疫[5,6]。在治疗上也提出肠道细菌在慢性肝病是一个治疗的靶点。

1 非酒精性脂肪性肝病、代谢炎症与细菌

不同肝病的发病机制与肠道细菌组成的改变有关。其中非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的临床综合征，肠道细菌也是胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病发生的关键性因子。而NAFLD少数患者也可发展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH),以至发生肝硬化和肝细胞癌[7～9]。

1.1 肠道细菌引起肝脏脂肪变的机制 研究显示肠道细菌改变在NAFLD发生和发展均发挥重要作用，如20多年前即有研究指出，用益生菌改变细菌组成 ，如用菊粉类果聚糖益生元可减轻肝脂肪变和新的脂肪生成减少[10,11]。这些研究对益生菌饲养的鼠可降低血浆三酰甘油和极低密度脂蛋白产生 。益生菌降低TG的作用是通过抑制所有的脂肪生成酶，即CoA羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、苹果酸酶、ATP柠檬酸裂解酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(图1)。在乙状结肠和门静脉肠道细菌被益生菌发酵发生SCFA；而乙酸和丙酸浓度双倍增加[12,13]。资料指出，可导致肝脂肪生成减少，而乙酸是一种脂源性底物。

益生菌/碳水化合物发酵

↓

SCFA

↓

肠上皮中丙酸

↓

抑制肝脂肪生成

↓

(抑制FAS、ACC、G6PD 、苹果酸酶)

↓

减轻肝脂肪变和肝炎症

图1益生菌抑制脂肪酸合成作用机制图

Le Roy 等[14]证实肠道细菌在NAFLD 发生上的作用，发现高脂肪饮食小鼠发生肥胖、胰岛素抵抗和NAFLD。基因背景与饮食环境作用相似，不同的细菌对食物可有不同反应，有应答和无应答者细菌的组成也不同。其原因尚不明了。试验清楚地指出，从NAFLD一开始即伴有特异的细菌组成 ，基于饮食如高脂肪饮食触发。

新近又提出细菌基因数与NAFLD 发病相关[15],特异细菌类群与代谢状况和基因计数(细菌基因丰度)有关。研究提示产生丁酸的细菌，如穗状丁酸弧菌(大肠菌群)、布替乌克菌、普拉梭菌、罗氏菌属、玫瑰布里亚菌，低基因数患者低丰度且伴有肥胖表型。其他特异益生菌如双歧杆菌、嗜黏蛋白-艾克曼菌(抗癌明星细菌)也明显减少，而瘤胃球菌、弯曲菌和沙门氏菌大量增加[15]。新近研究发现普罗氏菌、普通拟杆菌增加与人IR之间相关。同时还可加重胰岛素抵抗和触发葡萄糖不耐受[16]。Dao等[17]发现在肥胖人的黏液菌的丰度与内脏脂肪量、空腹血糖和脂肪细胞的大小呈负相关。他们也发现高基因计数(HGC)和黏液菌丰度显示改善胰岛素敏感性标记和心脏代谢风险因子。值得注意的是在啮齿动物细菌有保护抵抗饮食引起的肥胖、加强肠道屏障功能和降低轻度炎症等作用[18]。在肠道中嗜黏蛋白-艾克曼菌可特异地降解黏蛋白和低聚糖，分别产生SCFA和丙酸，在为宿主提供能量的同时也促进细菌自身的定植，细菌定植可减轻脂肪沉积，延缓糖尿病发生，定植还可促进宿主免疫系统的发育，进而促进肠道健康。

肠道细菌导致 NAFLD 发生是通过多种机制来实现。新近提出肠-肝轴是发生肥胖和NAFLD发病的关键机制。肠道细菌引起NAFLD是一个多因素复杂作用的结果，包括代谢内毒素血症、低度炎症、能量调节平衡失调、内源性大麻素样系统调节[19]、胆碱代谢调节、胆汁酸平衡的调节[20]、内源性乙醇产生增加[21]、小肠细菌过度生长[22]。肠道细菌通过刺激肝细胞Toll样受体(TLR)-9-依存性前纤维化途径导致肝纤维化[23](图2)。

饮食(即脂肪和果糖)+细菌或代谢改变

↓

肠道通透性增加

↓

LPS/肠菌产生毒素(血)

↓

肝TLR系统激活

↓

炎症前细胞因子产生增加

↓

肝脂肪变、炎症、损伤

↓

低度系统炎症

图2细菌引起NAFLD作用机制

饮食是驱动肠道细菌组成和代谢的主要因子。饮食因子和肠道细菌改变可影响肠道屏障功能引起内毒素血症，肠细菌产物或毒素激活肝细胞 Toll样受体产生炎症前细胞因子，诱导细胞因子和低度炎症产生，最终导致 NAFLD 发生[24]。

最近，有报道提出，生物钟是NAFLD 发病机制的关键枢纽。因FFA代谢不一致，引起脂肪蓄积，营养紊乱、核受体、激素和中间代谢改变影响信号途径，自噬和宿主细菌相互作用，尤其肝代谢途径和胆汁酸合成以及自噬和炎症过程的昼夜节律模式被生物钟驱动，致使肠道细菌影响生物钟[25]。

NAFLD通过胰岛素依存性失调，引起胰岛素抵抗和脂肪在肝蓄积，如前所述肠道细菌在NAFLD 是一个驱动器，肠-肝轴在NAFLD发病机制起关键作用，如通过细菌驱动细菌代谢产物进入门脉循环，可触发先天免疫，其反过来引起肝的炎症；此外，细菌生态失衡流行率高，细菌生态失衡时产生大量内源性乙醇、肠黏膜屏障渗透性增加和细菌易位发生[26]。细菌多不饱和脂肪酸代谢生成反式-11、反式-13共轭亚油酸，引起TG蓄积和脂肪生成基因增加，调节脂质代谢和发生脂肪变[27]。

1.2 肠道细菌与肝脏炎症导致NASH 肠道细菌能够通过特定分子与宿主细胞相互作用称为识别受体模式(PRRs)这些 PPRs将识别细菌和其他无效的特殊分子模式 ，即病原相关分子模式。研究发现肠道细菌从一开始就涉及IR、低度炎症和糖尿病把TLR信号途径激活，且发现G-菌脂多糖在血循环极低水平即可触发低度炎症和葡萄糖代谢，这个现象叫代谢内毒素血症。

在内源性或外源性PAMPs或损害相关分子模式(DAMPs),炎症小体认为是一个关键的传感器，它们控制炎症前细胞因子如前IL-1Β和 前IL-18的开环。基因炎症小体缺乏引起肠道菌群组成改变， 证实生态失衡导致了细菌产物在门脉循环的异常积聚，进一步增加肝脂肪变，而且证实炎症在NAFLD的一开始即出现[28]。

新近Duparc等[29]研究髓样分化初级反应基因88(MyD88),他们发现肝细胞特异性缺乏的小鼠对葡萄糖不耐受、肝脂肪蓄积和肝对胰岛素对抗易感与体重和肥胖无关。此外，此缺失严重影响肠道细菌组成 ，因此指出宿主基因塑造肠道微生物群，反过来改变宿主的新陈代谢。同时发现肝细胞MyD88调控胆汁酸合成和几种脂质的生物活性，参与葡萄糖、脂质代谢和炎症的调控[29]。生态失衡可触发肠道炎症和损害肠道屏障，细菌产物通过门脉血流到达肝脏，引起肝脏炎症和导致NAFLD 和 NASH进展[30,31]。

在生理情况下肠道细菌调节肝转录、蛋白质组学和代谢， 最值得注意的是细胞色素P4503A下调介导xenobiotic(异型生物质的)代谢。肠道细菌也调节肝基因表达的节律性，可能是通过细菌代谢，如丁酸和丙酸像是表观遗传调节。此外，肠道细菌改变可使宿主产生激素，如原发性胆汁酸和胰高糖素样肽1[32]。在人细菌影响代谢途径是关键[33]。肠道细菌还涉及肥胖 、MS、NAFLD 进展，新近提出黄酮类化合物檞皮素可有力调节肠道细菌组成。宏基因组学研究显示，HDF 引起引起肠道细菌生态失衡，厚壁菌门/拟杆菌门和G-菌比例增加，伴有内毒素血症，肠屏障功能障碍，由于肠-肝轴改变，引起炎症基因的过度表达。细菌生态失衡介导TLR-4-NF-КB信号途径激活导致炎症反应和引起内质网应激途径激活。檞皮素可逆转肠道细菌生态失衡和细菌生态失衡引起的TLR-4-NF-КB信号途径激活，对高脂肪饮食的小鼠起到保护作用，从而减轻炎症和脂肪的蓄积[34]。

2 肝病时肠道细菌引起肠道炎症和肠黏膜屏障功能障碍

2.1 肠道细菌引起肠道与肝脏炎症 人的肠道含有数万亿不同种属细菌与宿主共生在一个稳定的环境中,新近几年证明指出，肠道细菌代表一个重要的环境因子，一旦失衡则可能导致NAFLD 发生。 细菌对食物消化、营养吸收、合成维生素、肠道淋巴样结构发育、防止病菌定植等有重要作用，宿主给细菌提供营养和发展的空间，一旦细菌组成或功能改变(生态失衡)即可能引起疾病发生[35]。

许多不同的因子可改变细菌组成，包括基因因子、饮食和其他环境因子[36]。炎症或NOD样[核苷酸结合寡聚化结构域受体(NLRP)]缺陷给小鼠提供了一个生态失衡的遗传模式。NLRP炎症小体是NALP 在胞内识别胞内病原相关分子模式(PAMP)后与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)以半胱天冬氨酸酶前体等分子结合形成的蛋白复合物，活化后促进IL-1β、前IL-18或IL-33等炎症 因子的成熟和释放[37],主要是炎症小体成分NLRP6的缺乏导致肠菌生态失衡，特别证实有头孢普氏菌和灰斑病菌的增加[38]，在NLRP3和NLRP6缺乏的小鼠通过上皮细胞趋化因子配体(CCL5)诱导引起结肠炎症。CCL5 募集多样化的先天和适应免疫细胞进一步促进炎症发生。TLR抵抗LPS和细菌易位至门静脉和肝。这些细菌产物在肝与TLR4和TLR9结合，引起信号下调致使NAFLD 进展到NASH。细菌生态失衡引起肠炎症 ，进一步细菌产物通过门静脉易位到肝，增加肝病的进展。给小鼠喂食高脂肪也伴有肠炎症增加，高脂肪饮食和肠道细菌之间相互作用促进炎症发生[39]。

一旦肠炎症成为慢性，主要的严重后果是肠黏膜上皮屏障遭到破坏，导致渗透性增加，致使细菌和它的产物易位至门脉循环后到达肝引起炎症反应，加剧NAFLD 和NASH[40]。

2.2 肠道细菌与肠黏膜上皮屏障破坏 生理情况下上皮细胞相互紧密连接形成一个生理屏障 ，使细菌和系统循环很少接触。杯状细胞分泌糖蛋白形成黏液层复盖上皮，这个黏液层由内外两层组成，外层是一个松黏液层，含有大量细菌，为共生菌提供一个理想的生存场所，内层是一个无菌的坚固稠密的黏液层可防止细菌与上皮细胞直接接触。

共生菌对保持肠屏障完整性可能有益作用，如艾克曼菌[41],这些有益菌黏连至肠细胞，可保持正常的屏障功能。艾克曼菌是一种从粪便中分离到的严格厌氧肠道菌，可以利用肠道黏蛋白，其主要功能为调节肠道内黏液厚度和维持肠道完整性，它与肥胖、糖尿病、炎症和代谢紊乱呈负相关[42]。

抗菌分子包括防御素、抗菌肽溶酶体、C型凝集素等可阻止细菌与上皮细胞的相互作用[43]。抗菌蛋白通过溶酶体或非酶抗菌分子如防御素、抗菌肽等把细菌杀死。Reg3g 是一种C-型凝集素，在TLR-依存方式和TLR、TLR5配体引起Reg3g表达[44]，Reg3g缺乏的小鼠肠上皮细胞，特别是内黏液层的上皮细胞上有细菌定植增加，揭示Reg3g在上皮细胞和肠菌隔离上的重要作用。

肠道屏障功能破坏后，细菌和细菌产物从肠腔到达固有层，其机制是许多细菌易位通过 M-细胞(微褶细胞)，细菌蛋白与M-细胞特异的相互作用后经内化 、跨细胞转运，有些病原体可改变紧密连接分子，因而改变细胞旁渗透性，有些细菌激活MLCK(肌球蛋白轻链激酶)，引起紧密连接破坏[45]。

研究指出，TNF导致肠屏障功能障碍具有重要作用，TNF-1信号途径和下游事件是通过 MLCK激活肠细胞导致上皮屏障功能障碍。TNF由单核细胞和巨噬细胞产生。TNFR-1信号导致紧密连接蛋白丢失和降低屏障功能，增加细菌产物的易位，尤其重要的是肠炎症 、肠渗漏、病理性细菌易位是取决于生态失衡的严重程度，不吸收的抗菌素可阻止所有这些改变[46]。此外，活性氧(ROS)也与引起肠炎症密切相关，随后肠屏障破坏和肝损伤发生。CYP2E1介导ROS反应促进肠渗透性增加[47]。

3 肠道细菌与NASH

3.1 NASH 患者肠道细菌改变 有关NASH患者肠道细菌的研究很少，新近报告从NASH 患者大便中分离出拟杆菌属和普氏杆菌属比健康对照组有显著不同[48]，拟杆菌属高丰度且是独立的伴有NASH,普氏杆菌属降低，两者相互作用、相互竞争。饮食成分可影响这个平衡，西方饮食富含脂肪、动物蛋白和糖，支持拟杆菌属，且可伴发NASH[49]。除饮食外，几个其他因子 如LPS、内源性大麻素样系统、胆汁酸代谢等可使NASH患者的拟杆菌属比例增加，拟杆菌丰度与寡糖(含葡萄糖和果糖)、D-果糖儿茶素、脱氧胆酸增加和SCFA及氨基酸水平下降相关[50]。在人NASH时脱氧胆酸、果糖水平增高，且可引起肝细胞凋亡。

肠道细菌改变可导致肝纤维化，提出瘤胃球菌丰度与纤维化相关，且是一个独立因子。2个新近儿童NASH研究证实NASH患者大肠杆菌比健康对照组高,其他菌属包括阿里叶柄、布劳特氏菌属、柔球菌属、颤螺菌属和双歧杆菌水平降低。成人NASH 患者普氏杆菌水平降低，但儿童患者显著增高[51]。NAFLD 时SIBO流行率高达 56%,但NASH 与SIBO之间无显著相关性。

3.2肠道细菌导致NASH 机制

3.2.1 肠道炎症与肠屏障功能障碍 由于肠道屏障功能障碍，致使血清内毒素水平显著增高造成肝损伤。其机制为LPS或内毒素驱动肠道细菌易位，通过功能障碍的肠道屏障到达门静脉和肝，在肝激活炎症细胞引起炎症 反应。因此缺乏TLR-4和MyD88的小鼠可保护缺乏甲硫氨酸-胆碱饮食引起的肝脏炎症和脂肪储存[52],其他细菌产物也可引起肝病的进展。NASH 小鼠和患者血浆含高水平的线粒体DNA,是一种有效的TLR9激活剂。TLR9完全缺失和溶酶体产生细胞上缺乏TLR9的小鼠可保护高脂肪饮食诱导的肝脂肪变性和炎症[53]。肝暴露于细菌产物不一定是有害的，有些研究也证明细菌产物的有益作用。TLR5有保护作用，它识别细菌鞭毛，在缺乏甲硫氨酸-胆碱和高脂肪饮食的小鼠，当在肝细胞上小鼠缺乏TLR5时指出可使疾病加剧。

3.2.2 细菌代谢物 不少学者提出细菌代谢物也与NASH进展机制有关。新近报道在小儿NASH 患者的大便中发现2-丁酮和4-甲基-2-戊酮水平升高，宏基因组资料发现颤螺菌属水平降低，布劳特菌属、瘤胃球菌属水平增高，这些可提供作为诊断的生化标记物。另一个重要的进展是发现NASH 患者和NAFLD患者的乙醇血清浓度增高[54]。发现NASH 患者产生乙醇的细菌数量增加[51],在肝ADH活性降低后，胰岛素信号改变是造成乙醇代谢损害的原因[55]，今后需要进一步研究明确乙醇在NASH 进展上的作用。

3.2.3 胆汁酸代谢与NASH NASH时有胆汁酸谱改变，有高浓度胆汁酸水平，特别是与牛磺酸、甘氨酸结合的原发性胆汁酸和继发性胆汁酸水平比健康志愿者要高[56]。

胆汁酸是配体，在回肠肠细胞胆汁酸刺激核受体FXR释放成纤维生长因子(FGF-19)进入门脉循环。FGF-19到达肝细胞抑制胆汁酸合成途径中限速酶CYP7A1[57]。血清FGF-19在NASH和健康对照组之间不同[58],提示在回肠胆汁酸成分并不改变FXR的活性。尽管FGF-19水平不变，NASH的血清 C4(胆汁酸中间体和肝胆汁酸新生物合成指示器)水平比健康对照组高[58], 指出胆汁酸合成增加不是由肠生态失衡所驱动。

胆汁酸是一个配体，不仅对核受体FXR,但也驱动其他几个受体，包括细胞膜G蛋白偶联胆汁酸受体1(GPBAR1,也称TGR5,G蛋白偶联体5)。胆汁酸调节葡萄糖、脂质代谢 、产热和炎症[57,59]。胆汁酸驱动6-乙基脱氧胆酸(胆甾酸)，它是FXR(孕烷X受体)强有力的激动剂。一个双盲、安慰对照、随机临床试验指出，非肝硬化NASH 用胆甾酸口服，25 mg/d，72周后获得纤维化、肝脂肪变和小叶炎症改善。

3.2.4 脂毒性与NASH 肝细胞损伤和炎症的早期机制是过多的脂质相互作用所致。根据资料指出，肝细胞损伤是由于游离脂肪酸如棕榈酸、胆固醇、溶血磷脂酰胆碱和神经酰胺等，这些脂毒性影响细胞行为，通过各种机制包括级联和死亡受体信号激活、内质网应激、线粒体功能修饰和氧化应激等导致肝细胞的炎症、损伤。细胞和分子参与 肠和肝之间的相互作用，研究信号通过肠细菌和产物以及肠产生激素等在不同水平影响着肝的代谢，在多种机制的作用下导致 NASH的发生[60]。

3.2.5 肠道微生物群对蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食诱导的脂肪性肝炎的保护作用 最近的数据表明，NASH时有先天性免疫细胞浸润，如单核细胞源性巨噬细胞(MOMF)和中性粒细胞是肝炎症的介质。对MOMF浸润的药理学抑制改善了人和小鼠的NASH发展[61]。在NLRP3和NLRP6炎症缺陷小鼠中，不利的肠道微生物群与肠屏障完整性的丧失和MAMP易位到肝脏的增加有关，在那里它们激活TLR4和TLR9介导的肝脏炎症发生[62]。

MCD饮食是另一种公认的非酒精性脂肪性肝炎啮齿动物模型，可导致肝脏脂肪变性、氧化应激、炎症和纤维化。最近Schneider 等[63]研究了在MCD诱导的实验性NASH中肠道微生物群的相关性。结果发现微生物群减少增加小鼠MCD模型中脂肪性肝炎的发展；抗生素治疗可增加MCD喂养小鼠的肝脏脂肪积累，但与人类NASH的代谢表型特征无关；微生物群减少MCD诱导的脂肪性肝炎的炎症反应；肠道微生物群可预防过度肝纤维化；MCD饮食影响肠道内环境平衡和微生物群组成。

过度和营养不良被广泛认为是NASH的主要原因，然而，并非所有的肥胖患者都会发展为NASH，同时也有瘦弱的患者患上活动性NASH。这一观察表明，必须有额外的机制，例如，遗传或其他环境因素，驱动从简单脂肪变性向NASH的转变[64]。

维持肠道内稳态和屏障完整性依赖于宿主免疫系统和共生微生物群的复杂相互作用，这可能受到环境因素的阻碍，并受宿主遗传学的影响。有大量的实验证据表明，抗生素治疗或无菌(GF)小鼠肠道微生物群的耗竭可防止高脂肪饮食或西式饮食诱导的NASH发生[65]。