GPC-GC-MS/MS同时测定含油食品中16种邻苯二甲酸酯

◎ 袁荷芳，蒋晓勤，程 妍，倪嘉倩

（常州市食品药品监督检验中心，江苏 常州 213000）

邻苯二甲酸酯（缩写PAEs），又称酞酸酯，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。PAEs是一类能起到软化作用的化学品，它被普遍应用于玩具、食品包装、乙烯地板、清洁剂、指甲油、喷雾剂和洗发水等很多产品中[1]。大量研究表明，PAEs及其代谢产物能够对人体健康产生不利的影响[2-3]。欧洲安全局、美国、日本、中国也都先后将PAEs列入优先控制污染物的黑名单，PAEs对人类健康的危害已经引起世界的广泛关注。目前，很多含油食品包装都是使用的都是塑料包装，由于塑化剂是脂溶性的，很容易迁移至食品中，造成污染。

有关PAEs测定方法主要有气相色谱法[4]、高效液相色谱法[5]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[6]、液相色谱-串联质谱法[7]等。凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，GPC）技术已广泛用于去除油脂样品中的脂质和色素等干扰物，气相色谱/质谱法是目前对PAEs较为主要的检测方法。本实验将GPC与GC/MS技术相结合，研究了含油食品中16种PAEs的检测方法，为进一步了解目前市场上含油食品中PAEs的污染情况，保护消费者健康有着重要的意义。

1 实验部分

1.1 实验材料和试剂

色谱纯环己烷（国药集团化学制剂有限公司，批号：16080007）；色谱纯乙酸乙酯（国药集团化学制剂有限公司，批号：15030081）；色谱纯甲醇（德国默克，批号：1826907614）；分析纯丙酮（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160516）；1 000 mg·L-116种邻苯二甲酸酯混合标样，分别为邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二（2-甲氧基乙）酯、邻苯二甲酸二（4-甲基-2戊基）酯、邻苯二甲酸二(2- 乙氧基己)酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸苄丁酯、邻苯二甲酸二（2-丁氧乙）酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸二壬酯，购于上海安谱。

1.2 标准溶液的配制

16种邻苯二甲酸酯混合标样浓度为1 000 mg·L-1，准确移取1 mL混标，用环己烷定容至25 mL，配制成40 mg·L-1储备液。吸取一定量的储备液，配制成0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1和 8.0 mg·L-1标准系列溶液。置于4 ℃冰箱中避光保存，有效期3个月。

1.3 实验仪器

CP513电子天平（奥豪斯仪器常州有限公司）；WT5002K电子天平（常州万泰天平仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WXH-3微型旋涡混合器2800次/分（上海跃进医疗器械厂）；Freestyle全自动凝胶渗透色谱-在线浓缩-SPE系统配套固相萃取仪（德国LCTech）；全自动固相萃取仪（睿科仪器有限公司）；7890A-7000GC-MS/MS气相色谱-串联质谱仪（安捷伦科技有限公司），配电子轰击源（EI源）。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 μm；进样方式：自动进样；进样量：1 μL；不分流；分流比：20∶1；载气：高纯氦气（纯度≥99.999%）；载气流速：1 mL·min-1；进洋口温度：250 ℃；柱温箱温度：60 ℃用于 1 min，然后 20 ℃·min-1到 220 ℃，保持1 min，然后5 ℃·min-1到280 ℃，保持4 min，总时间为30 min。

1.5 质谱条件

质谱：EI电离方式，电离能70 eV；碰撞气：高纯氮气（99.999%）；GC-MS-MS接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描范围m/z 50～450；扫描方式：多离子反应监测模式（MRM）；溶剂延迟5 min。

2 结果与分析

2.1 邻苯二甲酸酯的提取方法的选择

2.1.1 超声提取法

准确称取1.0～2.0 g（精确至0.000 1 g）含油试样，加入色谱纯环己烷10.0 mL，超声提取10 min，静置后将上清液全部转移至玻璃试管中，40 ℃氮吹至近干，后用环己烷定容至1 mL，上GC-MS/MS进行测定，同时做试剂空白。实验发现，超声提取前处理方法不能有效去除杂质干扰，影响目标物的测定。

2.1.2 凝胶色谱净化法

称取0.5～1.0 g（精确至0.000 1 g）样品于15 mL样品瓶中，加入体积比为1∶1的乙酸乙酯、环己烷混合溶液10 mL，涡旋20 s，采用全自动凝胶色谱-在线浓缩-SPE系统配套固相萃取仪，用自动进样器取5 mL稀释后的样品溶液注入GPC，净化分离后，浓缩定容至2 mL，取1μL供GC-MS/MS分析，同时做试剂空白。

2.2 凝胶色谱净化方法的优化

2.2.1 凝胶渗透时间的优化

称取0.5 g食用油，加入16种邻苯二甲酸酯混标，按样品处理方法进行处理。将凝胶色谱柱流出端与浓缩器断开，准备一个放废液的烧杯收集预淋洗10 s，净化分离除杂质800 s后产生的溶液，之后准备12个2 mL收集瓶收集720 s流出液，每60 s收集一份，即每份1 mL，共12份，再用GC-MS/MS测定。结果发现，第1份和第12份未检出邻苯二甲酸酯。所以最终确定净化除杂质时间为720 s，主要收集时间720 s。

2.2.2 凝胶渗透温度的优化

浓缩温度直接影响了收集液的浓缩速度。研究比较了33、35、37、40、42 ℃和44 ℃对同一加标浓度回收率的影响，发现在33℃下浓缩的回收率较低，在45%以下。这可能是由于低的温度使浓缩的时间过长，反而损失各组分的回收率。35 ℃和37 ℃下浓缩各组分的回收率明显升高，两个温度没有明显差别。但随温度升高到42 ℃和44 ℃后，各组分回收率随之降低。考虑到较高的温度有机溶剂蒸发得快些，可以提高工作效率，故选择40 ℃为最终浓缩温度。

2.2.3 浓缩压强的优化

浓缩腔的预浓缩压强是指将收集液浓缩到5 mL这阶段所用压强，定容压强为最后定容阶段所用压强，通常预浓缩压强比定容压强低5 kPa，本研究比较了20～ 22、22～ 24、24～ 26、26～ 28 kPa以 及28～30 kPa等不同预浓缩压强-定容压强组合对同一加标浓度回收率的影响，发现在随压强的升高，各组分回收率相应的提高，但当预浓缩压强为22 kPa，定容压强为27 kPa达到稳定，再升高压强对大部分组分的回收率没有影响，有的组分的回收率甚至出现降低，故选择22 kPa为预浓缩压强，27 kPa为定容压强。

2.3 GC-MS/MS条件的优化

2.3.1 目标物母离子的选择

通过一级质谱图选择丰度较大且相对分子质量适中的碎片离子作为母离子。邻苯二甲酸二甲酯（m/z）163碎片离子峰相对丰度最大，邻苯二甲酸二（2-甲氧基乙）酯（m/z）59碎片离子峰相对丰度最大，邻苯二甲酸二（2-乙氧基己）酯（m/z）73碎片离子峰相对丰度最大，邻苯二甲酸二苯酯（m/z）225碎片离子峰相对丰度最大。其余12种邻苯二甲酸酯的所有碎片离子中（m/z）149的碎片离子峰相对丰度最大，因此其余12种邻苯二甲酸酯均选择（m/z）149作为母离子。然后从中选择2～3个碎片离子作为子离子（即为定量离子），12种邻苯二甲酸酯均选择（m/z）93、65作为子离子。

2.3.2 定量离子及定性离子的选择

三重四级杆可同时进行定性和定量分析，提供具体的分子量信息。一个母离子经过碰撞会得到一些子离子，而其中有比较稳定的，且峰度比较强的，可以选择作为定量离子，同时它也可以是定性离子。因为一个定量离子对还不能达到定性的鉴定点数，所以再选择两个离子对作为辅助定性的离子。

2.3.3 目标物碰撞电压的优化

三重四级杆串联质谱在扫描过程中，一般选取m/z大、信号强的离子作为前级离子，产物离子则选择前级离子裂解后产生的特征离子。本文分别通过全扫模式（scan）和产物离子扫描（Product-ion scan）确定组分的前级离子和特征产物离子，对前级离子生成产物离子过程中所需的电压进行优化，找到最佳的碰撞能量。

对于三重四极杆扫描质谱，其扫描速度和扫描时间也是影响其扫描结果的重要的因素。当扫描速度加快时，单位时间内采集的点数会增多，色谱峰模拟状况就越好，但扫描速度过快，相应的离子采集效率降低，噪声会变大，重现性降低。每个色谱峰最佳质谱采集点数为10～15个点，根据色谱峰的峰宽除以质谱采集点数可以得到合适的质谱扫描时间，以确定多反应监测扫描（MRM）的参数。

2.4 空白干扰

在前处理过程和正常的色谱分析条件下，空白样品中邻苯二甲酸酯很可能出峰，分析其来源可能有3个方面：①样品前处理操作过程中容器污染。②仪器管路污染。③进样隔垫、样品瓶隔垫及进样针等引入污染。

针对以上原因，采用了如下3个步骤控制空白：①容器空白。实验用到的所有器皿在每次使用之前均用色谱纯环己烷清洗3遍。②采用体积比为1∶1的乙酸乙酯、环己烷混和溶剂清洗GPC管路。③采用超高惰性隔垫，工作曲线最高浓度点与样品之间加2个溶剂样品用于洗针。通过上述步骤，邻苯二甲酸酯空白出峰问题得到了有效控制。

2.5 方法的评价

2.5.1 邻苯二甲酸酯标准曲线、线性方程及相关系数

邻苯二甲酸酯储备液用环己烷稀释，配制质量浓度分别为 0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1和 8.0 mg·L-1的系列标准溶液，进行测定，以各目标化合物的质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，确定方法的线性范围及相关系数R2。

2.5.2 方法准确度和精密度

将低、中、高不同质量浓度水平的混合标准溶液添加到空白样中，分别制成100、1 000 μg·kg-1的加标样品，同时做空白样品实验。每个水平平行做6次，回收率与相对标准偏差（RSD）结果见表1。

表1 样品加标回收率及精密度表

续表1

3 实际样品分析与讨论

用本文建立的方法对市场上随机抽查的50个食用油及含油样品进行检测，检出4个阳性样品。16种邻苯二甲酸酯中检出3种，分别是DIBP、DBP和DEHP，这3种化合物都是欧盟REACH法规高度关切物质清单中的化合物，是目前我国使用较为广泛的增塑剂，阳性样品检出值见表2。

表2 阳性样品检出值表

欧盟令2007/19/EC和我国GB 9685-2008均规定了DBP和DEHP在食品中的特定迁移限量为1.5 mg·kg-1和0.3 mg·kg-1（目前DIBP还没有限量规定），因此有3个样品超过限量要求。出现这种情况有可能是原材料所处的生长环境空气、灌溉水和土壤中含有邻苯二甲酸酯类，整个采集、运输、加工、储藏过程中与含有邻苯二甲酸酯类的塑料管道或其他环境相接触，特别是储藏容器和产品包装中如果含有邻苯二甲酸酯类，长时间接触都很有可能把邻苯二甲酸酯类迁移到含油食品中。

本研究采用凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱法对含油中16种邻苯二甲酸酯进行分析检测。该方法在0～16 mg·kg-1范围内具有良好的线性，相关系数R2在0.998 64～0.999 22。含油脂样品中16种邻苯二甲酸酯的加标回收率为84.85%～107.45%；方法检出限为100～200 μg·kg-1，相对标准偏差（n=6）在2.0%～5.0%。本方法准确、稳定、简便、重复性较好，该方法的准确度符合食品中痕量物质检测要求，可应用于含油脂食品中16种邻苯二甲酸酯的实际检测分析。