微生物法测定大米中叶酸含量的研究

◎ 赵 平，郭莹莹，杨 光，王哲明，丁松乔

（1.黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150028；2.国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江），黑龙江 哈尔滨 150028）

叶酸是一种水溶性维生素，为维生素B复合体之一，又叫维生素B9，人类如果缺乏叶酸，会引起巨幼红细胞贫血与白细胞减少症。天然叶酸广泛存在于动植物类食品中，尤以肝及绿叶蔬菜中含量比较多[1-2]。

大米是人们生活中的主食之一，其富含丰富的B族维生素，可为人体提供所需的维生素。本实验应用微生物法来测定分析大米中原生叶酸的含量，以鼠李糖乳杆菌为测试菌种，叶酸是其生长必需的营养素，利用其对叶酸的特异性，通过其生长测定大米中原生叶酸的含量，建立大米中原生叶酸含量测定的方法[3-5]。

1 实验材料与方法

1.1 实验试样

大米，产地为黑龙江。

1.2 实验试剂与实验菌种

叶酸标准品（≥99%），磷酸氢二钠，抗坏血酸，盐酸，氢氧化钠，木瓜蛋白酶，α-淀粉酶，鸡胰腺，0.85%氯化钠溶液，叶酸测定用培养基，乳酸杆菌肉汤培养基，鼠李糖乳杆菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC 7469）。

1.3 实验设备与仪器

天平（感量0.1 mg），恒温震荡培养箱，离心机，电热鼓风干燥箱，生化培养箱，液体分装泵，pH计，洁净台，分光光度计，微量移液器，高压蒸汽灭菌釜，涡旋振荡仪。

1.4 实验方法

1.4.1 玻璃器皿的准备

将玻璃仪器清洗干净，然后烘干备用。

1.4.2 实验菌种的制备

将鼠李糖乳杆菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC 7469）甘油管（实验室保存）无菌操作转接至乳酸杆菌肉汤中，37 ℃摇床培养24 h，备用。

塔巴林，藏语意为“解脱园”，修建于清乾隆三十六年（1771年），相传是噶丹东竹林寺第三世扎唐活佛倡建。当时，在距寺院约有五里的林地中，有一处尼姑庵，只有几名尼姑住在简易木棚中修习。另外在奔子栏镇支央村有一处小的尼姑庵，也只有几名尼姑，僧舍也极其落魄。鉴于迪庆境内没有一座像样的尼姑寺，三世扎唐活佛决定合并两处小的尼姑庵，用内地买来的布匹换下现今的寺址（寺址原来是东竹林寺所在地），并命名为“塔巴林”，为广大女性信徒提供了一处修行地。

1.4.3 试样的制备与提取

准确称取大米试样（经粉碎，过筛）10 g，至150 mL锥形瓶中。加入20 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ（14.2 g磷酸氢二钠，用1 000 mL水溶解。临用前按1.0 g/100 mL加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液调pH至7.7～7.9），混匀后加50 mL水和1.0 mL甲苯。加盖后121 ℃灭菌15 min，然后迅速冷却。加1mL木瓜蛋白酶溶液，于（36±1）℃保温3 h后100 ℃加热3 min，冷却。加1 mL α-淀粉酶溶液，（36±1）℃保温2 h后加4 mL鸡胰腺，加盖，（36±1）℃保温16 h后100 ℃加热3 min，冷却。用1 mol/L盐酸调pH至4.5，用水稀释定容到100 mL。过滤得到澄清滤液，然后吸取1 mL澄清滤液用磷酸盐缓冲液Ⅲ（14.2 g磷酸氢二钠，用1 000 mL水溶解。临用前按1.0 g/100 mL加入抗坏血酸，用氢氧化钠溶液调pH至6.7～6.9）定容至100 mL。同时做空白对照。

1.4.4 叶酸标准曲线管制备

取试管分别加入实验用水（GB/T 6682-2008规定的二 级 水）5.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0、2.0、1.0、0.0 mL，每支试管中加入5.0 mL叶酸测定用培养基，再按相应顺序加入叶酸标准工作液（0.05 ng·mL-1）0.0、0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 和标准工作液（0.1 ng·mL-1）3.0、4.0、5.0 mL，相当叶酸含量为0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 ng和0.50 ng，每个梯度做3支平行管，试管加塞，121 ℃灭菌5 min。

1.4.5 试样系列管的制备

取4支试管，分别加入4.0、3.0、2.0、1.0 mL水，试样提取液，1.0、2.0、3.0、4.0 mL，然后加入5.0 mL叶酸测定用培养基。每个梯度做3支平行管。试管加塞，121 ℃灭菌 5 min。

1.4.6 接种液的制备

菌种活化好后，将菌悬液无菌条件下离心弃去上清，用无菌生理盐水离心洗涤菌体，弃上清，反复2～3次。以生理盐水做对照，用分光光度计测试菌液透光率，将菌液透光率调至为73%，备用。

试管灭菌后，冷却，每支试管以无菌操作方式接入调好的菌液50 µL，标准曲线管中未接种叶酸标样的S1空白管除外。置37 ℃生化培养箱中培养20 h。

1.4.8 叶酸标准曲线的测定与绘制

目测检查试管，S1未接种菌液管应是澄清的，如有混浊出现，则无效。用涡旋振荡器混合每一支试管中培养液后，将培养液移入比色皿中波长550 nm处测定吸光度。以吸光度OD值为横坐标，叶酸标准品的含量（ng）为纵坐标绘制标准曲线。

以S2接种空白管为空白调零，测试每支试管的OD值。

通过叶酸标准曲线，用OD值来计算每毫升培养液中叶酸的含量，并计算该编号的叶酸含量的平均值。用该平均值计算得出全部编号的总平均值为Cx。

叶酸含量

式（1）中：X为叶酸含量，µg/100g；Cx为总平均值，ng；m为质量，g；f为稀释倍数；EB为鸡胰腺空白管中叶酸含量，ng/mL。

2 结果与分析

2.1 叶酸标准曲线的绘制

培养20 h后，OD值在叶酸含量为0～0.5 ng范围内的线性良好，以吸光度为横坐标（x）、叶酸含量为纵坐标（y）绘制叶酸标准曲线为y=1.3024x2+0.4676x，r=0.996 6，如图1所示。

图1 吸光度与叶酸含量标准曲线图

2.2 重复性试验

同一批次大米样，精密称取10次，依照此方法测定叶酸的含量，结果表明方法的重现性良好，见表1。由表1可得，10次检测的平均值为12.4 µg/100 g，RSD为0.03%。

表1 重复性试验结果表

2.3 回收率试验

精密称取同一批次大米样品6份，2份样品做平行实验测出大米的本底叶酸含量，其余4份样品进行加标实验，测定叶酸含量并计算叶酸加标回收率，结果计算得出回收率分别为98.9%、98.4%、97.8%、95.3%，平均回收率为97.6%，RSD为0.016%。

3 结论

本实验通过利用微生物法对大米中原生叶酸含量的测定分析，测得大米样品中原生叶酸含量的RSD为0.03%（n=10），平均回收率达97.6%。表明微生物法测定大米中原生叶酸含量的方法重现性好、精密度高、可靠性强、灵敏度高、样品的制备与叶酸提取操作简单，适用于大米中原生叶酸含量的测定。