生、制首乌正己烷提取物对维甲酸致小鼠骨质疏松的防治作用

吴晓青，陈晓珍,刘睿颖,任瑶瑶,蒋合众,谭 睿*

1西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031；2中国科学院成都生物研究所，成都 610041

何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根，是著名的生熟异治中药，有生首乌和制首乌之分。生品性平，味甘、苦；归心、肝、大肠经；制品性变温、味转甘，归肝、肾经。功善补益精血，固肾乌须。骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少，骨脆性增加以及骨折危险性增高为特征的骨代谢性疾病。原发性OP是绝经后老年妇女的一种常见病、多发病，随着世界人口老龄化的发展，老年性OP发病率也呈上升趋势，WHO已将其列为三大老年性疾病之一。

目前临床上用于治疗OP的药物主要有钙剂、雌激素、维生素D、降钙素类、双磷酸盐类等，虽然临床上具有一定的疗效，但不良反应较多。中药治疗骨质疏松症日益受到青睐，但其肝毒性也已引起重视。有些疗效确切、临床用药广、关注度高的知名中药如壮骨关节丸、仙灵骨葆胶囊(《2012版中国国家基本药物目录》在列唯一补肾壮骨中成药)等有肝脏不良反应，且均已在《药品不良反应信息通报》公开，这对临床安全、合理用药带来极大挑战。前期我们发现，制首乌无毒[2]。已有研究报道，制何首乌含药血清能促进成骨细胞增殖[1]，大黄素能促进骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)向成骨细胞方向分化，抑制BMSCs向脂肪细胞方向分化[3]。二苯乙烯苷能促进BMSCs碱性磷酸酶表达，刺激骨钙素分泌，上调Collal和Runx2 mRNA的表达，增加Wnt信号通路核心蛋白(β-catenin ) mRNA和蛋白的表达[4]。生、制首乌正己烷提取物对维甲酸诱发的骨质疏松是否有作用，未见报道。本实验通过检测骨代谢相关生化指标、骨密度、骨显微结构等探讨生、制首乌正己烷提取物对维甲酸致小鼠骨质疏松症的药效作用，为生、制首乌正己烷提取物的进一步开发利用和临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

1.1.1 生、制首乌正己烷提取物的制备

称取生或制首乌粉末100 g，加入500 mL无水乙醇，超声波振荡提取1 h,过滤，重复提取二次，合并提取液，减压回收溶剂至干，加入150 mL蒸馏水悬浮，用正己烷200 mL×3 萃取，合并萃取液，减压浓缩至干，浸膏用作抗骨质疏松药效学实验。

1.1.2 药物

生、制首乌正己烷提取物。用0.5%羧甲基纤维素水溶液制成混悬，备用;尼尔雌醇片,北京四环制药有限公司公司生产；维甲酸(retinoic acid,RA)，重庆华邦生化制药有限公司产品。

1.2 实验动物

昆明系小鼠，雌雄各半，开始试验体重32～34 g,购于四川省医学实验动物中心SCXK[川] 2008-14，每天接受12 h光照/12 h黑暗，光照周期为8∶00～20∶00，实验室温度20±2 ℃，湿度60%，动物可以自行摄取标准饲料和清洁用水，动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。小鼠适性饲养一周后进行实验。

1.3 分组及给药方案

取昆明种小鼠，SPF级，180只随机分组为正常对照组、模型组(维甲酸105 mg·kg-1)，阳性对照组(尼尔雌醇2 mg·kg-1)，生首乌正己烷提取物高、低剂量组48、24 mg·kg-1，清蒸制首乌正己烷提取物高、低剂量组48、24 mg·kg-1，黑豆制何首乌正己烷提取物高、低剂量组48、24 mg·kg-1，每组20只，除正常对照组于每日上午灌胃生理盐水外，其它各组均于每日上午灌服维甲酸105 mg·kg-1,连续灌胃14 d，在造模的同时，阳性对照组及生、制首乌各剂量组给予不同浓度的受试药，给药期间隔天称量体重以调整给药量，停药次日，小鼠摘眼球取血，取股骨。

1.4 血清生化及相关激素检测

血清钙，ALP，TRAP检测均按照试剂说明书进行，血清BGP，E2的含量用放免法测定。

1.5 骨组织形态计量学检测

取股骨用10%的福尔马林固定。常规石腊包埋，切片，HE染色，光镜观察骨组织形态。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 对血液生化指标的影响

与正常组比较，模型组血钙水平下降，用药后血清钙水平升高，生首乌各剂量组与模型组比较无显著性差异，制首乌各剂量组显著升高(P<0.05)。模型组s-ALP,s-TRAP显著升高(P<0.05)，生、制首乌各剂量组与模型组相比明显降低(P<0.05，P<0.01)(见表1)。

2.2 对骨代谢相关激素水平的影响

模型组小鼠s-BGP水平显著高于正常组(P<0.05)。生、制首乌各剂量组能降低s-BGP水平，但与模型组比较无统计学差异。与正常组比较，模型组s-E2水平下降，生、制首乌各剂量组使体内s-E2显著上升(P<0.05)(见表2)。

2.3 病理学形态观察

从常规病理切片来看，正常组骨皮质完整，较厚，骨髓腔内容物多，骨小梁大小粗细均匀，骨髓数量较多；模型组皮质变薄，骨小梁数量减少较为稀疏，细少，骨髓数量减少。各治疗组与模型组比较，骨组织形态均有不同程度的改善，其中豆制首乌高、低剂量组骨皮质显著增厚，骨骺生长较活跃，骨小梁较为粗大，相互连接，排列整齐；阳性药组与模型组比较，骨皮质亦有增厚，骨小梁数量多且连接良好。

表1 生、制首乌对血液生化指标的影响Table 1 Effect of Raw and Processed Polygoni Multiflori on Blood Biochemical

注：与模型组比较1)P<0.05，2)P<0.01，与空白对照组比较3)P<0.01，
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01

表2 生、制首乌对骨代谢相关激素水平的影响Table 2 Effects of raw and Processed Polygoni multiflori on hormones related to bone

注：与模型组比较1)P<0.05，2)P<0.01，与空白对照组比较3)P<0.01。
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01.

2.4 骨组织静态计量学观察

骨组织静态计量学指标观察表明，模型组小鼠发生了骨质疏松改变，表现在骨小梁数量及形态变化，骨小梁数量比正常组减少约50%，MTPT(平均骨小梁宽度)明显变窄(P<0.01)，MBCT(平均骨皮质厚度)明显变薄(P<0.01)。经各给药组治疗后，与模型组比较，上述指标都出现了明显改善，骨小梁数明显增加(见表3)。

3 讨论

维甲酸是维生素A的衍生物，临床上主要用于肿瘤的化疗和皮肤病的治疗，大剂量服用会引发骨密度降低和骨形态结构的改变，进而造成骨质疏松。该反应与雌激素缺乏引起的骨质疏松极为相似，因此常被用作小鼠急性骨质疏松的造模方法[5]。骨代谢指标具有创伤小、快速灵敏的特点，对评价骨的状态有重要意义。血清碱性磷酸酶(s-ALP)可以部份反映成骨细胞的活性；抗酒石酸酸性磷酸酶(s-TRAP)是反应骨吸收的特征性酶[6]。本实验中，模型组小鼠s-ALP,s-TRAP显著升高(P<0.05)，生、制首乌各剂量组与模型组相比明显降低(P<0.05，P<0.01)，结果表明维甲酸可造成高转换型骨质疏松。生、制首乌正己烷提取物可显著降低小鼠血清ALP和TRAP的水平，提示生、制首乌正己烷提取物可抑制骨吸，减小骨丢失。BGP是成骨细胞合成和分泌的一种非胶原蛋白，是反应骨更新情况的一项特异性指标[7]。生、制首乌各剂量组能降低s-BGP水平，但与模型组比较无统计学差异。从实验所得数据可以看出，模型组小鼠发生了骨质疏松改变，骨小梁数量及形态变化，骨小梁数量比正常组减少约50%，这一现象与临床上骨质疏松样症状相符[8，9]，经各给药组治疗后，上述指标都出现了明显改善。

图1 骨组织病理切片 Fig.1 Bone tissue biopsy注：A 正常组；B 模型组;C 阳性组;D 生首乌高剂量组;E 生首乌中剂量组;F 清蒸制高剂量组;G 清蒸制中剂量组;H 黑豆制高剂量组;I 黑豆制中剂量组 Note: A Normal group；B Model group；C Positive group；D Raw radix polygoni multiflori high dose group；E Raw radix polygoni multiflori middle dose group；F Steaming raw radix polygoni multiflori high dose group；G Steaming raw radix polygoni multiflori high dose group；H Black soya bean high dose group；I Black soya bean middle dose group

表3 生、制首乌对骨组织静态计量学指标的影响Table 3 Effects of raw and Processed Polygoni Multiflori Recipe on Static Metrology Indexes of Bone

注：与模型组比较1)P<0.05，2)P<0.01，与空白对照组比较3)P<0.01。
Note:Compared with model group,1)P<0.05，2)P<0.01;Compared with control group,3)P<0.01.

中医理论认为“肝肾同源，乙癸同源，精血同源” 骨骼的生长发育和修复有依赖于精血的营养滋润，肝肾亏虚则精血无源，无以生精养骨，髓枯筋痰，发为骨屡。发生骨质疏松症的主要原因是年老体弱、肾气不足、肾阳虚和肾阴虚、筋骨失养、经络不通、气血疲阻，属本虚标实之疾。制首乌，补肝肾，药用价值极高。制首乌正己烷提取物能升高维甲酸所致骨质疏松症小鼠的的骨密度，同时能有效改善骨小梁微结构退化的现象，有效抑制维甲酸所致骨质疏松症小鼠的高骨转换状态，增加钙吸收率，降低骨吸收，能有效地预防和治疗骨质疏松症，生、制首乌提取物对维甲酸致小鼠骨质疏松的治疗作用，其机制可能与减缓雌激素水平降低，抑制骨高转换有关，但制首乌临床使用毒性远小于生首乌，因此可作为治疗骨质疏松的有效药物之一。