不同产地槐米的质量综合评价研究

谭 均，李隆云*，王计瑞，丁 刚，徐 进

1重庆市中药研究院；2重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心；3重庆市中药资源学重点实验室； 4中国中医科学院中药资源中心重庆分中心，重庆400065

槐米为豆科植物国槐SophorajaponicaL.的干燥花蕾，具有清热、凉血、止血的功效[1]。现代药理研究表明槐米具有保护心脑血管[2,3]、改善糖尿病[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]和抑制黑色素生成[7]等作用。槐米中含有大量的黄酮及其苷类成分，如芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素、山奈酚、染料木素等[8,9]。槐米的产地在中国分布范围较广，由于各地气候、地形、土壤条件等不同，所产槐米质量也不均一。李振志[10]等研究发现不同产地槐米中芦丁的含量有显著性差异，其中以广西桂林产含量最高。国槐的花期为6～8月，在不同时期，槐花中黄酮类成分的含量也有较大差异[11]。为了综合开发槐米产品及保障用药安全，有必要对各产地槐米药材的质量进行全面的评价。Liu[8]等采用UPLC-MS/MS法同时测定了槐米中5种黄酮类成分，但是检测成本较高，不易推广。本实验建立了同时测定槐米中芦丁、水仙苷、槲皮素和异鼠李素4种成分的HPLC方法，对不同产地槐米中4种成分含量进行测定，并通过主成分分析法进行评价；参照2015版《中华人民共和国药典》[1]对不同产地槐米药材进行水分和灰分的检查以及浸出物和总黄酮的含量测定并采用聚类分析法进行归类。通过以上研究，更加全面地评价各地槐米的质量，为槐米药材的临床使用和产品开发提供依据。

1 仪器与试药

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司，美国；DAD检测器)，UV 2600紫外分光光度计(岛津公司，日本)，Milli(Q Integral 5型纯水仪(Millipoer公司，美国)，BSA 124(S型电子天平(Sartorius，德国)，KQ(250 DB型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，中国)，8(10型马弗炉(沈阳节能电炉厂，中国)，XMTB数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司，中国)，G2X(9240 MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，中国)。

对照品：芦丁对照品(批号：MUST(16070511，纯度：≥ 99%)、槲皮素对照品(批号：MUST(16072203，纯度：≥ 98%)、异鼠李素对照品(批号：MUST(16092001，纯度：≥ 98%)购自成都曼斯特生物科技有限公司；水仙苷对照品(批号：TAQT(LRLA，纯度：≥ 93.1%)购自中国食品药品检定研究院。

试剂：乙腈(TEDIA公司，美国；色谱纯)、甲醇(TEDIA公司，美国；色谱纯)、醋酸(TEDIA公司，美国；色谱纯)，其它试剂均为分析纯。

样品产地：在全国范围内共收集样品54批，详细信息见表1。样品经重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定为豆科植物国槐SophorajaponicaL.的干燥花蕾。

表1 槐米样品来源Table 1 Origin of Flos Sophorae Immaturus

续表1(Continued Tab.1)

编号No.产地Habitat编号No.产地HabitatBF-21安徽省 亳州市(药市购)NF-23重庆市 万州区 甘宁镇 甘宁乡BF-22安徽省 亳州市 谯城区 十九里镇NF-24重庆市 万州区 柱山乡 青高村BF-23江苏省 邳州市 八义集镇石桥村NF-25重庆市 大足区 珠溪镇 宝珠村BF-24江苏省 邳州市 占城镇NF-26重庆市 大足区 宝顶镇 鸡公岭BF-25江苏省 宿迁市NF-27重庆市 涪陵区 太和乡 白果村NF-1湖北省 武汉市NF-28重庆市 北碚区 西山坪村NF-2湖南省 永州市 蔡市镇 三龙塘村NF-29四川省 乐山市 沙湾区 碧山乡

2 实验方法

2.1 水分、灰分、浸出物及总黄酮的检测

样品处理及检测方法按照《中华人民共和国药典》[1]中相关方法进行检测。

2.2 4种黄酮类成分含量测定

2.2.1 色谱分析条件

色谱柱：Inertsil®ODS-3(250 mm × 4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)- 1%醋酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～5 min，5% A；5～10 min，5% → 20% A；10～20 min，20% A；20～30 min，20% → 32% A；30～45 min，32% → 35%A；45～50 min，35% → 5% A；50～55 min，5% A。流速1.0 mL/min，检测波长257 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 对照品(A)和槐米供试品(B)的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and Flos Sophorae Immaturus sample (B)注：1.芦丁,2.水仙苷,3.槲皮素,4.异鼠李素。Note:1.rutin,2.narcissin,3.quercetin,4.isorhamnetin.

2.2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取对照品水仙苷6.04 mg、槲皮素10.18 mg、异鼠李素3.00 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密移取上述水仙苷溶液2 mL、槲皮素溶液2 mL、异鼠李素溶液0.5 mL与芦丁9.04 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得芦丁浓度为904.0 μg/mL、水仙苷浓度为120.8 μg/mL、槲皮素浓度为203.6 μg/mL、异鼠李素浓度为15.0 μg/mL的混合对照品溶液。再稀释得到梯度浓度的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取干燥槐米样品粉末(过60目筛)0.1 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，称定质量。于25 ℃超声处理(功率400 W，频率40 kHz)30 min，冷却，用甲醇补足失重，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察

将梯度浓度的混合对照品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进样检测。以各对照品峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X，μg/mL)为横坐标，做标准曲线，芦丁的线性方程为Y=18.872X+34.875，r=0.999 9；水仙苷的线性方程为Y=9.763X-1.661，r=0.999 8；槲皮素的线性方程为Y=17.583X-14.405，r=0.999 9；异鼠李素的线性方程为Y=16.203X-3.285，r=0.999 9。结果表明，芦丁在56.5～904.0 μg/mL、水仙苷在7.6～120.8 μg/mL、槲皮素在1.6～203.6 μg/mL、异鼠李素在 0.9～15.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4.2 检测限与定量限

配制一系列质量浓度由高到低的对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测。以信噪比为3时考察检测限、信噪比为10时考察定量限，结果表明芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素的检测限分别为159、329、223、234 ng/mL，定量限分别为556、940、556、938 ng/mL。

2.2.4.3 精密度试验

取同一混合对照品溶液按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分的峰面积。结果芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素峰面积RSD分别为1.26%、2.18%、1.27%、2.14%、1.58%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.4 重复性试验

取同一来源槐米样品，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录各成分的峰面积。结果芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素峰面积RSD分别为1.87%、1.90%、1.44%、1.34%，表明本方法重现性良好。

2.2.4.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录各成分的峰面积。结果芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素峰面积RSD分别为1.11%、1.24%、1.99%、1.32%，表明供试品溶液于24 h内测定结果稳定。

2.2.4.6 回收率试验

精密称取已知含量的同一来源槐米样品6份，每份0.05 g，分别精密添加与样品中含量相当的芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，计算得到芦丁的平均加样回收率为100.31%，RSD为1.73%；水仙苷的平均加样回收率为103.77%，RSD为1.85%；槲皮素的平均加样回收率为100.63%，RSD为2.75%；异鼠李素的平均加样回收率为101.93%；RSD为2.55%。结果表明本方法的回收率良好。

3 结果与分析

3.1 水分、灰分、浸出物及总黄酮的检测

槐米样品中水分、灰分、浸出物及总黄酮的检测结果见表2。结果显示54批槐米样品的水分含量在4.83%～10.81%之间，均低于11.00%，符合药典规定；总灰分含量在3.42%～8.93%之间，均低于9.00%，酸不溶性灰分含量在0.73%～2.93%之间，均低于3.00%，符合药典规定。南方产样品30%甲醇浸出物含量在43.69%～55.11%之间，均符合药典规定；北方产样品30%甲醇浸出物含量在32.38%～52.56%之间，差异较大，其中BF-4、BF-6、BF-9、BF-10和BF-24 的含量低于药典对槐米浸出物的要求。南方产槐米样品中总黄酮含量在20.10%～42.98%之间，均符合药典规定；北方产样品总黄酮含量在9.91%～25.55%之间，仅有7批(BF-2、BF-7、BF-8、BF-11、BF-13、BF-18和BF-24)合格，说明南方产槐米样品普遍优于北方。

表2 槐米中水分、灰分、浸出物和总黄酮测定结果Table 2 The determination of moisture,ash,total flavonoids extract in Flos Sophorae Immaturus

续表2(Continued Tab.2)

编号No.水分Moisture(%)总灰分Total ash(%)酸不溶性灰分Acid-insoluble ash(%)30%乙醇浸出物30% Ethnaol extract(%)总黄酮Total flavonoids(%)BF-167.70±0.833.42±0.550.73±0.0147.74±4.1517.72±0.19#BF-179.91±0.368.47±0.361.99±0.7847.08±5.109.91±0.22#BF-187.61±0.626.32±0.841.70±0.2550.45±1.0021.50±1.09BF-1910.36±0.827.71±0.202.9 1±0.8045.70±0.3014.93±1.10#BF-209.51±0.916.93±0.821.47±0.2944.22±2.0016.34±0.36#BF-2110.81±0.176.51±0.391.38±0.0246.33±2.2919.68±0.07#BF-228.56±0.647.81±0.341.58±0.1143.60±1.2218.50±0.13#BF-235.40±0.187.40±0.732.01±0.4244.72±2.6518.79±0.20#BF-249.71±0.396.02±0.291.80±0.5241.15±4.47#23.90±0.02BF-256.31±0.528.38±0.472.21±0.3646.03±1.3813.42±0.46#NF-110.81±0.925.03±0.661.03±0.3048.90±2.4220.10±0.67NF-28.61±4.598.19±0.492.18±0.3243.69±3.0438.30±0.55NF-37.62±0.498.20±1.131.78±0.0548.95±1.6639.08±0.54NF-46.92±0.616.38±0.631.39±0.3345.43±0.7022.20±0.98NF-57.59±0.827.29±0.812.23±0.4744.55±1.3039.67±1.17NF-68.80±0.318.11±0.472.08±0.3147.78±3.5122.98±0.74NF-79.21±0.458.39±0.991.87±0.6245.34±4.6634.75±1.89NF-810.17±0.427.02±0.462.01±0.4949.64±3.1338.25±0.73NF-99.82±0.736.64±0.831.19±0.1346.56±2.1935.43±0.56NF-108.83±0.866.45±0.421.01±0.2849.99±1.3442.98±0.45NF-119.83±0.127.22±0.472.17±0.2246.48±1.8936.17±0.45NF-1210.28±0.418.28±0.731.93±0.2045.38±2.1935.24±0.46NF-1310.11±0.685.39±0.941.32±0.5248.31±1.1941.60±0.62NF-146.32±0.918.42±0.852.00±0.0344.64±2.1134.98±0.84NF-157.49±0.827.21±0.172.02±0.1246.87±2.8938.02±0.80NF-167.73±0.298.39±0.772.38±0.4846.66±5.7937.25±0.11NF-178.92±0.736.62±0.501.81±0.3350.49±1.1735.46±0.42NF-189.01±0.378.93±0.852.33±0.4745.27±3.9837.51±0.47NF-199.96±0.828.30±0.412.62±0.8155.11±1.7832.91±0.26NF-2010.13±0.567.79±0.831.88±0.3047.19±2.3531.06±0.79NF-218.31±0.796.48±0.311.19±0.0751.27±3.7837.81±0.50NF-227.23±0.175.32±0.811.12±0.0148.68±4.0732.16±0.66NF-238.29±0.426.39±0.961.43±0.2950.28±3.1438.45±0.26NF-248.47±0.915.22±0.390.99±0.2751.72±4.1836.66±0.36NF-259.25±0.317.19±0.981.28±0.0946.16±2.8731.89±0.67NF-268.73±0.278.53±0.822.93±0.3548.36±2.1933.66±0.84NF-277.79±3.178.17±0.101.83±0.4944.78±1.9839.55±0.83NF-286.53±0.866.93±0.381.42±0.2845.83±2.0239.12±0.79NF-299.27±0.787.49±0.401.67±0.3946.83±1.1926.04±0.68药典规定Pharmacopeial regulations11.009.003.0043.0020.00

注：“#”表示低于药典规定。
Note:"#" indicates that the content is below the Pharmacopeial regulations.

3.2 4种黄酮类成分含量测定

按“2.2.3”项下方法每个样品平行制备3份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图。根据线性方程分别计算芦丁、水仙苷、槲皮素和异鼠李素的百分含量，结果见表3。

表3 槐米中4种成分含量测定结果Table 3 Determination results of 4 components in Flos Sophorae Immaturus

续表3(Continued Tab.3)

编号No.芦丁Rutin(%)水仙苷Narcissin(%)槲皮素Quercitrin(%)异鼠李素Isorhamnetin(%)PCA得分排序PCA score sortNF-1132.217 3±0.713 02.802 8±0.088 10.234 2±0.020 5-4NF-1230.948 2±0.192 12.494 0±0.021 80.564 1±0.013 5-8NF-1337.801 1±0.153 72.558 5±0.006 00.154 0±0.001 9-3NF-1430.125 6±0.330 91.906 0±0.016 91.533 5±0.012 8-18NF-1534.278 6±0.521 82.217 3±0.083 20.521 8±0.005 39NF-1631.822 9±1.643 01.890 5±0.163 42.344 6±0.078 90.152 1±0.006 37NF-1729.446 6±0.339 41.513 0±0.157 43.491 9±0.203 20.230 3±0.007 912NF-1831.242 6±1.184 41.941 7±0.085 51.844 6±0.072 00.120 4±0.005 511NF-1924.993 7±0.215 11.171 5±0.217 74.539 4±0.017 20.270 0±0.000 420NF-2026.726 8±0.527 21.576 1±0.018 81.940 6±0.004 80.117 8±0.001 021NF-2130.902 6±0.322 51.537 7±0.010 93.618 8±0.062 00.200 9±0.003 110NF-2225.462 2±1.125 61.458 8±0.071 54.034 0±0.142 70.234 5±0.008 515NF-2333.733 8±0.617 41.745 1±0.036 72.415 3±0.006 40.154 7±0.000 76NF-2431.829 7±1.919 91.644 3±0.459 41.548 5±0.037 70.112 6±0.002 714NF-2525.948 2±2.217 61.627 4±0.144 83.119 4±0.223 30.189 4±0.012 016NF-2627.345 7±1.842 81.452 8±0.987 13.211 5±0.310 10.175 4±0.008 619NF-2736.354 0±1.478 12.730 9±0.169 20.266 5±0.010 6 - 2NF-2835.562 2±0.738 41.452 5±0.968 40.621 8±0.102 70.215 4±0.038 613NF-2920.437 8±0.812 31.009 7±0.038 43.779 7±0.109 70.230 7±0.005 627药典规定Pharmacopeial regulations15未控制 Uncontrolled未控制 Uncontrolled未控制Uncontrolled-

注：“-”表示在当前浓度下未检出；“#”表示低于药典规定。
Note:"-" indicates that no concentration was detected at the current concentration;"#" indicates that the content is below the Pharmacopeial regulations.

由结果可知，南方产槐米样品中芦丁含量在18.402 2%～37.801 1%之间，均符合药典规定；其中武汉(NF-1)产槐米中芦丁含量最低，推测这与其处于平原地区，气候与其他中南、西南高海拔产区差异较大有关。北方产样品芦丁含量在5.530 0%～21.879 5%之间，其中约有一半不合格。

南方和北方样品中水仙苷、槲皮素和异鼠李素含量也有较大差异。水仙苷含量分别为0.544 6%～2.802 8%和0.124 2%～1.796 5%；而槲皮素和异鼠李素含量在北方样品中均出现了未检出的情况，且明显南方样品优于北方样品。

3.3 化学模式识别

3.3.1 聚类分析

浸出物、总黄酮及单个黄酮类成分含量是评价槐米质量的重要指标。本研究以浸出物、总黄酮含量、芦丁、水仙苷、槲皮素和异鼠李素含量的标准化数据为变量，运用SPSS 20.0 软件，以平方欧氏距离作为度量标准，对54批样品进行系统聚类分析，结果见图2。54批样品共被分为3大类，其中北方产槐米被聚为一类；南方产槐米可分为2类，产于湖南、云南、广西的被归为一类，产于重庆、四川的被归为一类。结果表明，南、北方所产槐米质量有较大差异，说明槐米的质量受地域及气候的影响较大。

3.3.2 主成分分析

运用SPSS 20.0软件，以槐米中芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素含量作为变量，以特征值和累计贡献率作为判定依据，对不同产地槐米进行主成分分析。根据降维结果，共挑选出2个主成分PC1、PC2，特征值分别为2.036、1.510。各成分方差贡献值分别为50.893%、37.751%，累积贡献值达到88.644%，具有较强的代表性，可用来评价槐米的质量。

图2 槐米样品聚类分析Fig.2 Cluster analysis of Flos Sophorae Immaturus

表4 因子载荷矩阵Table 4 Initial factor load matrix

根据各因子载荷矩阵及特征值计算得分系数，进一步得到PC1、PC2及综合得分(Y)方程式：

PC1=0.327ZX1+0.227ZX2+0.395ZX3-0.389ZX4

PC2=0.424ZX1+0.489ZX2+0.343ZX3+0.356ZX4

ZX1、ZX2、ZX3、ZX4分别为芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素的标准化值。

Y=0.574PC1+0.426PC2

利用上式计算各地槐米质量综合得分并按结果高低进行排序，结果见表3。得分越高，表明槐米质量越好，排名越靠前。排名靠前的样品多产于南方地区，排名靠后的多产于北方地区，说明南方产槐米质量普遍优于北方。由主成分得分图(图3)可知，除甘肃省礼县红河镇的一批样品(BF-6)离散，其它产地样品可分为3大类。其中产地位于南方的可分为2大类，产地位于北方的聚集为1类，分类结果与聚类分析结果一致，均表明槐米样品质量受南、北方地域因素的影响较大。此外，由表4及图4可知，PC1主要反映了槲皮素和异鼠李素的信息，PC2主要反映了水仙苷的信息；PC1和PC2对芦丁信息的反应程度相近。因此Ⅱ类与Ⅰ、Ⅲ类分开的主要原因是前者含有较高的水仙苷，Ⅰ类与Ⅲ类分开的主要原因则是槲皮素和异鼠李素含量的差异。

图3 主成分得分图Fig.3 Scores plot from principal component analysis

图4 主成分因子分析图Fig.4 Loadings plots from principal component analysis

4 结论

本研究建立了可同时检测芦丁、水仙苷、槲皮素和异鼠李素4种黄酮类成分的HPLC方法，方法学验证均符合药典中相关规定，表明该方法准确、可行。由于槐米中芦丁的含量很高，是其他成分的几十倍，故在对槐米进行质量控制时，大多只检测芦丁一种成分[1]。但有研究表明，槐米中芦丁和槲皮素的含量在槐米的成长过程中是反向变化的[12]，且其他黄酮类成分也具有较强的药理活性[13-16]，因此有必要对槐米中多种成分进行检测。本实验分别选用了WATERS Symmetry C18、SWELL Chromplus®C18和Inertsil®ODS-3三种类型色谱柱，Agilent 1260和1200两个系列高效液相色谱仪，对不同药材粉末浓度(0.4～2.0 mg/mL)提取液中芦丁的吸附饱和度进行考察。结果表明，当提取液药材粉末浓度为2.0 mg/mL时，三种色谱柱均未达到饱和，芦丁色谱峰面积重复性较好(RSD ≤ 2%)，且在两个系列的高效液相色谱仪上均能检测到多数样品中水仙苷、槲皮素的峰面积和部分样品中异鼠李素的峰面积，并可做定量检测(≥ LOQ)。

此外，本研究对全国各主要产地槐米的质量指标进行了较全面地考察。通过化学模式识别法分析浸出物、总黄酮和芦丁、水仙苷、槲皮素、异鼠李素含量，结果可将54批槐米样品分为3大类，表明其质量与地域有较大相关性。南方产槐米的质量普遍优于北方产槐米，其中以重庆、广西、湖南为代表的西南、中南地区所产槐米质量优异，表明海拔和气候对药材质量有较大影响[17-19]。