轮作方式对甘薯根际土壤线虫群落结构及甘薯产量的影响*

乔月静, 刘 琪, 曾昭海, 胡跃高, 高志强**



轮作方式对甘薯根际土壤线虫群落结构及甘薯产量的影响*

乔月静1, 刘 琪1, 曾昭海2, 胡跃高2, 高志强1**

(1. 山西农业大学农学院 太谷 030801; 2. 中国农业大学农学院 北京 100193)

甘薯茎线虫()是国际检疫植物寄生线虫, 甘薯茎线虫病是危害我国甘薯生产的严重病害之一。本文通过不同种植方式下甘薯根际土壤线虫群落结构的变化, 探索轮作对甘薯茎线虫病防治的作用, 明确变性梯度凝胶电泳(DGGE)在土壤线虫群落研究上应用的可行性。试验在河北省卢龙县多年连作的甘薯地上进行, 种植方式分别为: A1, 休闲→甘薯; A2, 玉米—冬闲→甘薯; A3, 玉米—黑麦→甘薯; A4, 大豆—冬闲→甘薯; A5, 大豆—黑麦→甘薯; CK, 甘薯连作。提取3个时期甘薯根际土壤线虫, 扩增线虫ITS区序列, 采用DGGE技术分析土壤线虫群落。结果表明, 与连作相比, 轮作方式显著提高甘薯根际土壤线虫群落多样性, 降低根际土壤甘薯茎线虫数量(<0.05), 冬季轮作黑麦(A3, A5)使甘薯根际土壤线虫群落结构更加稳定, 随时间变化幅度小。甘薯根际土壤中检测到的线虫优势属有: 茎线虫属、矛线虫属、滑刃线虫属、头叶线虫属、短体线虫属、小环线虫属、刺线虫属、真滑刃线虫属、双胃线虫属。轮作方式提高甘薯产量42.08%~55.83%, 降低病情指数22.72%~30.79%, 不同轮作方式之间对甘薯产量和病情的影响差异不显著, 收获期的甘薯茎线虫数量与甘薯产量和病情指数显著相关(<0.05)。因此, 轮作方式能够显著提高甘薯根际土壤线虫群落多样性和甘薯产量, DGGE可有效检测土壤线虫群落; 大豆—黑麦→甘薯是经济效益和生态效益较好的轮作措施。

轮作; 根际土壤; 线虫群落; 甘薯茎线虫; DGGE

土壤线虫是土壤微生态环境中最丰富而敏感的生物类群之一, 每平方米土壤中可达数百万条[1]。从土壤中将线虫分离出来较容易, 分离效率可达97%~99%, 线虫生活于土壤间隙水中, 与环境直接接触, 移动速度缓慢, 可反映小尺度土壤微生境的变化[2-3]。线虫世代周期较短, 一般为数天或几个月, 可在短时间内对环境变化做出响应。因此, 线虫作为土壤健康指示生物受到广泛重视[4-5]。甘薯茎线虫()是一种国际检疫植物寄生线虫, 甘薯茎线虫病已成为制约我国甘薯()生产的严重病害之一, 在山东、河北、北京、河南、江苏等省市均有分布, 一般发病田块减产20%~50%, 重病田块基本上绝产无收, 造成了巨大的经济损失[6-8]。目前我国甘薯产区仍然以化学防治为主要手段[9-10], 但连年施用杀线剂破坏生态环境, 污染水体, 还会使茎线虫产生抗药性[11-13]。轮作是防治植物寄生线虫病害的重要措施, 小麦()与茄子()、冬瓜()等作物轮作可以降低土壤中燕麦孢囊线虫()种群密度[14], 轮作系统还能降低大豆胞囊线虫()病害的发生[15]。金凤柱等[16]研究表明甘薯与玉米()、黑麦()轮作可减少甘薯茎线虫数量, 提高甘薯产量。土壤线虫优势营养类群和优势属种可以有效地指示农业土壤健康状况和线虫病害的发生程度[17-19]。因此研究轮作种植下甘薯根际土壤线虫群落结构, 对探索轮作防治甘薯茎线虫病和甘薯生产有理论指导意义。目前, 以土壤线虫群落为对象的研究多以形态学鉴定方法为主[20-22], 也有少数应用分子生物学技术[23]。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)作为土壤微生物群落多样性分析的重要技术[24], 在检测线虫群落方面也有报道[25-26]。Foucher等[27]用DGGE和形态学方法比较检测土样中线虫的丰度, 发现两种方法并无直接相关。Wang等[28]研究铜污染的土壤中线虫的多样性, 发现以形态学方法鉴定对照与处理无区别, 但用DGGE鉴别重污染土壤线虫多样性显著低于对照。DGGE也常被用于食细菌线虫群落的研究中[29-30]。但至今国内外鲜有将DGGE应用于甘薯土壤线虫群落的研究上。

本研究利用PCR-DGGE技术, 研究不同种植方式下甘薯根际土壤线虫群落的变化, 结合甘薯产量、病情指数, 揭示轮作措施防治甘薯茎线虫病的效果及对甘薯产量的影响, 明确DGGE技术在土壤线虫群落研究上应用的可行性, 为通过构建合理种植制度来控制和预防甘薯茎线虫病的发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验处理

试验地位于河北省卢龙县(39º48¢N, 119º20¢E), 试验田为甘薯连作7年的耕地, 土壤为典型的褐土, 耕层土壤有机质22.19 g∙kg-1、全氮1.1 g∙kg-1、碱解氮48.28 mg∙kg-1、有效磷11.91 mg∙kg-1、有效钾59.2 mg∙kg-1, 土壤pH为7.2。试验于2014年5月到2015年10月进行。设置6个处理, 分别为休闲→甘薯(A1)、玉米—冬闲→甘薯(A2)、玉米—黑麦→甘薯(A3)、大豆—冬闲→甘薯(A4)、大豆—黑麦→甘薯(A5)、甘薯连作(CK), 每个处理3次重复, 18个小区随机区组分布, 小区面积为4 m×5 m。甘薯品种为当地的主栽品种‘一窝红’, 其他作物取用当地推广种植的品种, 玉米为‘中地77号’, 黑麦为‘托亚’, 大豆(为‘壮元青’。轮作作物玉米和大豆2014年5月1日播种, 10月1日收获, 当日播种黑麦, 2015年4月28日收获。甘薯于2015年5月1日栽植, 9月25日收获。

1.2 取样方法与线虫分离

分别于2015年5月、7月、9月, 采集甘薯根际土壤(根系附着的土壤), 每小区随机取3个点, 过筛混匀称取30 g土样。采用改良的贝尔曼漏斗法[31]分离线虫。收集线虫于1.5 mL离心管中, 去离子水反复清洗3次后, 保留50 μL水, 破碎虫体, 加入40 μL的10×PCR buffer和10 μL 1 mg∙mL-1蛋白酶K, 95 ℃加热15 min后, 65 ℃水浴1.5 h, 线虫总DNA保存在-20 ℃待用。

1.3 线虫总DNA提取与PCR-DGGE

PCR扩增区间为线虫的ITS1区, 引物为ITS-F(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)、ITS-R (5′-ACGAGCCGAGTGATCCACCG-3′)[32]。50 μL扩增反应体系中包含: 5 μL 10×Buffer, 2 μL dNTP (25 mmol∙L-1), 2 μL引物(10 μmol∙L-1), 模板1.5 μL, Taq DNA聚合酶2.5 U, 无菌ddH2O补加到50 μL。PCR反应程序: 预变性94 ℃ 3 min, 变性94 ℃ 30 s, 退火58 ℃ 45 min, 延伸72 ℃ 1 min, 40个循环, 延伸72 ℃ 10 min。PCR产物经检测纯化进行变性凝胶电泳分析, 采用Bio-Rad公司DcodTM的DCode Univeral Detection System Instrument对PCR产物进行分离。本试验采用单梯度法, 聚丙烯酰胺凝胶的浓度是6%; 变性剂浓度范围20%~60%, 在0.5×TAE缓冲液(DGGE专用)中75 V电压电泳10 h, 温度61 ℃。凝胶采用SYBR Green Ⅰ染色30 min, 用凝胶影像分析仪AIphaImager 2200观测, 并回收特征条带测序。

1.4 甘薯产量和病情指数测定

收获时, 测定每小区甘薯产量, 并随机选择10株进行甘薯病情指数调查, 只有病情指数为0级和1级的甘薯计入产量, 其他没有食用价值不计入产量。薯块病情分级标准为[33]:

0级: 薯块无症状; 1级: 薯块症状面积在1/4以下; 2级: 薯块症状面积在1/4~1/2; 3级: 薯块症状面积在1/2~3/4; 4级: 薯块症状面积在3/4以上, 无食用价值。

病情指数=[∑(薯块级别×该级薯块数)/(调查总薯块数×最高级别)]×100 (1)

1.5 数据分析

PCR-DGGE图谱采用Bio-Rad公司的Quantity One软件分析, SAS 9.0进行方差分析, Mega 5软件对测序结果进行序列并比对后, 在NCBI上利用Blast搜索GenBank上的所有序列, 获取同源性高的序列信息。

通过DGGE凝胶图谱分析条带的数量和相对强度并计算Shannon指数()、丰富度()来评价样品中线虫的多样性[34]:

式中:p是第种在总体中的个体比例。

2 结果与分析

2.1 轮作方式对土壤线虫群落影响的分析

甘薯根际土壤线虫群落DGGE图谱(图1)显示, 不同泳道的优势条带各异, 也存在一些共同的优势条带。说明不同种植方式对于土壤线虫群落结构有明显影响, 不同处理土壤具有不同的优势种群, 也有部分种群普遍存在于各处理土壤中, 但其种群丰度各有不同。

图1 不同轮作方式下甘薯根际土壤线虫ITS区扩增片段的DGGE图谱(泳道编号见表1, B1-B15示条带)

依据3次重复的PCR-DGGE凝胶分析, 得到各处理的Shannon指数和丰富度, 结果如表1所示。A5处理3个时期的线虫群落多样性指数显著高于其他处理, 而CK的9月和A1的5月显著低于其他处理; A1 中7月群落多样性最高; A2和A4随采样时间推移而升高; A3和A5 3个时期各自群落多样性无显著差异。CK的丰富度也显著低于其他处理(前期工作发现CK 3个时期的图谱无差异, 多样性极低, 因此这里只列出9月份的CK作为代表)。

使用Bio-Rad公司Quantity One图像分析软件绘制不同土壤之间的遗传簇关系(图2)。通过各泳道所代表遗传簇的异同, 表示各处理土壤中线虫群落之间的基因多样性及亲缘关系。聚类分析(UPGMA)显示, 不同种植方式的3个时期大体相近, 而A3却与CK相近。

表1 不同轮作方式下甘薯根际土壤线虫群落多样性和丰富度指数

同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著(=3)。Different lowercase letters in the same column mean significant differences at 0.05 level (= 3).

图2 不同轮作方式下甘薯根际线虫群落的聚类图谱(编号见表1)

用SAS. V8软件insight模块对DGGE检测到的所有线虫群落做主成分分析, 图3所示是前两个主成分的平面坐标, 这两个主成分可以反映全部信息的102.53%, A2和A4两处理的3个时期都非常相近, A3和A5各时期也各自相近, 而A1各时期则相距较远。

图3 不同轮作方式下甘薯根际线虫群落的主成分分析(编号见表1)

从DGGE凝胶上分离了15条优势或特征条带, 测得序列导入Genbank比对。检测到的线虫属于以下10个种属, B1、B8、B11属于矛线虫属(), B2茎线虫属(), B3滑刃线虫属(), B4、B12头叶线虫属(), B5短体线虫属(), B6小环线虫属(), B7刺线虫属(), B9真滑刃线虫属(), B10双胃线虫属(), B13、B14和B15属环节动物门(Annelida), 如表2

表2 不同轮作方式下甘薯根际线虫群落DGGE图谱优势特征条带的ITS序列(条带标号见图1)

根据这些优势特征条带在DGGE凝胶图谱上的相对强度, 评估得出其所属种属在不同种植方式的土壤中线虫群落中所占比例。如图4所示, 不同处理中的优势种群各有不同, 而茎线虫属在各处理中均为优势种群; 矛线虫属在各轮作处理中所占比例与茎线虫属相当, 在休闲和连作处理中比例较小; 头叶线虫属存在于各轮作及休闲处理的各时期, 在连作中并未检测到; 真滑刃线虫仅在A2和A5处理中检测到; 刺线虫属仅在A5中检测到。短体线虫仅在A3和CK处理中发现。

图4 不同轮作方式甘薯根际土壤优势线虫群落的比例分布图(编号见表1)

2.2 轮作方式对甘薯产量、病情指数及甘薯茎线虫数量的影响

如表3所示, 不同轮作处理均能显著提高甘薯产量, 降低病情指数, 各轮作处理间无显著差异。与甘薯连作相比, 各轮作处理的甘薯产量提高42.08%~55.83%, 病情指数降低22.72%~30.79%。

表3 不同轮作方式下甘薯的产量及病情指数

同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著(=3)。Different small letters in the same column mean significant differences at 0.05 level (= 3).

如图5所示, A1、A2、A3和A4茎线虫数量在5月和7月差异不显著, 9月显著高于前两个时期; A5和CK茎线虫随生育期推移呈显著上升趋势, 且连作CK下的茎线虫数量显著多于其他种植方式。说明随着薯块的成熟, 尤其到收获期, 甘薯茎线虫数量明显增加, 而连作甘薯土壤中茎线虫始终保持较高数量。

图5 不同轮作方式的甘薯茎线虫数量变化

不同字母表示不同处理不同时期差异显著。Different lowercase letters show significant differences among different treatments at different periods at 0.05 level.

不同种植方式的甘薯产量、病情指数与甘薯3个生育期根际土壤茎线虫数量的Pearson相关性分析显示(表4), 茎线虫数量与甘薯产量多数呈负相关, 其中A5和CK连作9月的茎线虫数量与各自的产量呈显著负相关, 说明大部分样品中茎线虫数量越多, 甘薯产量就越低, A5和CK尤其如此; 茎线虫数量与病情指数多呈正相关, A1和CK 9月茎线虫数量与病情指数显著正相关, 说明大多样品茎线虫数量越高, 病情指数也就越高, 且A1和CK处理9月茎线虫的数量显著影响到病情指数。

3 讨论

本研究所设6种种植方式中, 甘薯连作的线虫群落多样性显著低于5种轮作方式, 大豆—黑麦→甘薯模式最高; 4种轮作方式中, 玉米—冬闲→甘薯和大豆—冬闲→甘薯线虫群落多样性随甘薯生育进程而升高; 玉米—黑麦→甘薯和大豆—黑麦→甘薯5月、7月和9月3个时期没有显著差异。表明轮作方式能够显著提高甘薯根际土壤线虫群落的多样性, 其中大豆—黑麦→甘薯轮作模式效果最好, 冬季轮作黑麦后使得甘薯根际土壤线虫群落结构更加稳定, 随时间变化差异小。聚类分析和主成分分析结果表明, 同一种植方式不同时期甘薯根际线虫群落聚类相似, 说明土壤线虫群落虽然在不同生育期有所变化, 但轮作方式对其群落结构的影响比生育期更大。在农业生产过程中, 任何影响土壤环境的因素, 诸如耕作措施、栽培方式、土地利用方式、化肥和农药使用等, 都能对土壤线虫群落结构产生一定的影响[35-37]。轮作措施对线虫病害防治的报道有很多, 如: 在长期轮作的农田系统中, 随着轮作的进行大豆胞囊线虫的数量缓慢减少, 轮作12季度后, 胞囊线虫数量达到平衡[15]; 水旱轮作可以有效防止蔬菜根结线虫[37]; 与蔬菜轮作后使水稻潜根线虫()数量下降88.1%, 水稻增产34.1%[38]。但是, 关于轮作方式对线虫群落结构的影响报道较少, 多是通过形态学鉴定以Shannon多样性指数、SR丰富度指数和J均匀度指数分析土壤线虫群落的营养结构, 如海棠等[39]发现不同耕作制度使甘薯地土壤线虫营养类群发生变化, 轮作可减少植物寄生线虫种类和数量, 增加食细菌和食真菌线虫的数量。而本研究应用DGGE技术直观展示了土壤线虫群落种类的多样性。

表4 不同轮作方式的甘薯产量及病情指数与茎线虫数量的相关关系

*: 0.05<<0.1; **: 0.01<<0.05; ***: 0.001<<0.01.

海棠等[40]用形态学方法鉴定出连作甘薯地极优势属为茎线虫属, 轮作、休闲模式下极优势属为头叶线虫属、真头叶线虫属()、滑刃线虫属和真滑刃线虫属。在本研究中, 应用PCR-DGGE检测到的甘薯根际线虫优势种属有茎线虫属、矛线虫属、滑刃线虫属、头叶线虫属、短体线虫属、小环线虫属、刺线虫属、真滑刃线虫属、双胃线虫属。其中茎线虫在所有处理中比例均很高, 因为试验土壤已连作甘薯多年, 轮作1年并没有改变茎线虫属的优势地位, 今后需要进一步研究多年轮作是否能改变其种群丰度; 矛线虫是杂食捕食类线虫, 在轮作种植方式下与茎线虫属比例相当; 在连作和玉米—黑麦→甘薯土壤中发现的短体线虫()也是一种植物寄生线虫, 取食根部, 多危害玉米[41]。在轮作种植方式中检测到更多的线虫种属, 比如头叶线虫属、真滑刃线虫属、双胃线虫属, 在大豆—黑麦→甘薯轮作模式中发现了其他模式中未检测到的刺线虫属。可见应用PCR-DGGE检测到的线虫种类与形态学方法得出结果相似。虽然DGGE技术检测土壤线虫群落多样性没有传统形态学方法鉴定到的种属多, 但是形态学鉴定通常多用于线虫食性分类[35-22], 如要准确鉴定到种属水平则耗时耗力, 且要求较高的线虫形态学相关知识和技术, 不易实现, 而DGGE却可以简单直观地展现线虫群落结构, 是土壤微生态研究者了解线虫群落的有效工具。

很多研究表明轮作方式是提高作物产量、防治病虫害的重要措施, 轮作玉米和大豆对棉花(spp.)的肾形线虫()有抑制作用[42]; 种植黑麦草()可以显著降低根结线虫的繁殖率[43]; 休闲与轮作还可以有效降低燕麦孢囊线虫密度[14]; 轮作影响大豆胞囊线虫的报道也很多[44-45]。金凤柱等[16]研究表明, 轮作+覆盖+抗病品种可使甘薯产量增幅达161.73%, 茎线虫属数量下降54.33%; 乔月静等[46]发现玉米—黑麦→甘薯轮作模式使甘薯产量增幅108.24%, 茎线虫属降低44.51%。本研究结果显示, 各种轮作方式和休闲都可显著提高甘薯产量, 降低病情指数, 而各轮作处理之间的产量和病情没有显著差异, 其中玉米—黑麦→甘薯稍好, 大豆—黑麦→甘薯次之。轮作种植对茎线虫数量的防治效果说明各轮作方式根际土壤茎线虫数量都得到了有效控制, 其中大豆—黑麦→甘薯整体茎线虫数量最低。甘薯3个生育期根际土壤茎线虫数量与各自的甘薯产量、病情指数的Pearson相关性分析显示, 大部分样品中茎线虫数量越多, 甘薯产量就越低, 大豆—黑麦→甘薯和连作对照尤其如此; 相反的, 大部分样品茎线虫数量越多, 甘薯病情指数也就越高, 且9月收获期茎线虫的数量与甘薯产量和病情指数显著相关。综合来看, 大豆—黑麦→甘薯处理下, 土壤线虫群落多样性和甘薯产量高, 茎线虫数量和病情指数低, 是经济效益和生态效益都较好的一种轮作措施。

4 结论

研究证明, 轮作能显著提高甘薯根际土壤线虫群落多样性(<0.05); 冬季轮作黑麦可使甘薯根际土壤线虫群落结构更加稳定, 随时间变化幅度小; 根据PCR-DGGE检测到的甘薯根际线虫种属有茎线虫属、矛线虫属、滑刃线虫属、头叶线虫属、短体线虫属、小环线虫属、刺线虫属、真滑刃线虫属、双胃线虫属, 其中茎线虫属在各种种植方式中均是极优势种属, 其次为矛线虫属、滑刃线虫属和头叶线虫属。与甘薯连作相比, 轮作方式提高甘薯产量42.08%~55.83%, 降低病情指数22.72%~30.79%, 并显著降低根际土壤茎线虫数量(<0.05); 收获期甘薯茎线虫的数量与甘薯产量和病情指数显著相关。大豆—黑麦→甘薯是经济效益和生态效益较好的轮作措施。

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Effect of rotation on nematode community diversity in rhizosphere soils and yield of sweet potato*

QIAO Yuejing1, LIU Qi1, ZENG Zhaohai2, HU Yuegao2, GAO Zhiqiang1**

(1. College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2. College of Agronomy, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

Sweet potato rot nematode () is a severe disease that can cause significant loss of sweet potato yield and that can destroy biotic community diversity in rhizosphere soils. In this study, nematode community structure in rhizosphere soils under sweet potato were investigated to verify the impact of rotation cropping patterns on rot nematode disease and the feasibility of denatured gradient gel electrophoresis (DGGE) in soil nematode research. The experiment was conducted on a long-term continuous sweet potato field in Lulong County, Hebei Province in 2014 to (→) 2015, where sweet potato rot nematode disease was seriously epidemic. The cropping patterns were included A1 (fallow→sweet potato), A2 (maize—fallow→sweet potato) A3 (maize—rye→sweet potato), A4 (bean—fallow→sweet potato), A5 (bean—rye→sweet potato) and CK (continuous sweet potato cropping). The nematodes were separately extracted from sweet potato rhizosphere soil in May, July and September in 2015, and the ITS genes analyzed using PCR-DGGE. The results showed that compared with continuous cropping, crop rotation significantly increased the diversity of nematode community, and decreased the population of sweet potato rot nematode in rhizosphere soil (< 0.05). Community structure of nematodes in rhizosphere soil under sweet potato was stabilized by winter rotation with rye (A3 and A5). Based on PCR-DGGE, 9 genera of nematodes were detected in the rhizosphere soil of sweet potato —,,,,,,,, and. Whilewas the dominant genus in all the cropping patterns,,andwere the main genera. Crop rotation increased sweet potato yield by 42.08%-55.83% and decreased disease index by 22.72%-30.79%. However, different crop rotations had no significant difference on sweet potato yield and disease index. The population ofwas significantly related with sweet potato yield and disease index at harvest time (< 0.05). Therefore, crop rotation significantly increased the diversity of nematode communities in sweet potato rhizosphere soils and sweet potato yield. And DGGE was proved to be a useful tool to detect soil nematode community. For the economic and ecological effects, bean—rye→sweet potato was the best rotation pattern for the study area.

Crop rotation; Rhizosphere soil; Nematode community; Sweet potato rot nematode; DGGE

, E-mail: gaozhiqiang1964@126.com

Sep. 23, 2018

Jun. 4, 2018;

S344.13

A

2096-6237(2019)01-0020-10

10.13930/j.cnki.cjea.180524

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* 山西省自然科学面上青年基金项目(201701D221181)、山西省回国留学人员科研项目(2016-068)和国家现代农业产业技术体系专项资金(CARS-03-01-24)资助

高志强, 主要从事作物栽培与耕作研究。E-mail: gaozhiqiang1964@126.com

乔月静, 主要从事土壤微生态群落研究。E-mail: qyjsxau@126.com

2018-06-04

2018-09-23

* This study was supported by the Shanxi Provincial Natural Science Foundation for Youths (201701D221181), Shanxi Scholarship Council of China (2016-068), and the Special Fund for the Industrial System Construction of Modern Agriculture of China (CARS-03-01-24).