临床前期类风湿关节炎的自身免疫

王 丹，刘 静，袁国华

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病。临床前期类风湿关节炎(preclinical rheumatoid arthritis，pre-RA)是RA的早期疾病发展阶段，机体在达到RA的疾病诊断标准之前，体内疾病发展已经开始。RA的发展是一个长期过程，从RA的发病到临床症状的出现，需要经历多个病程阶段。EULAR将RA的发生与发展分为6个阶段(A～F)，即A-遗传风险因素阶段(genetic risk factors for RA)、B-环境风险因素阶段(environmental risk factors for RA)、C-RA相关的系统性自身免疫阶段(systemic autoimmunity associated with RA)、D-无临床关节炎症状阶段(symptoms without clinical arthritis)、E-未分化关节炎阶段(unclassified arthritis)、F-类风湿关节炎阶段(RA)[1]。将A～E期统称为临床前期类风湿关节炎(pre-RA)，为高危个体发展为RA的早期病程。目前，许多研究表明，在临床RA症状出现之前，即pre-RA期患者体内多已存在自身免疫紊乱状态[2]。

1 pre-RA自身免疫紊乱的诱导产生

多项研究表明，RA的发展有一个较长病程，概括来说，包括危险因素诱导阶段、自身免疫阶段、症状阶段、临床关节炎阶段，即在RA特征性关节炎出现之前，患者体内已存在局限性或系统性自身免疫。pre-RA的自身免疫状态多存在自身抗体和其他生物标志物的异常，而缺乏以RA为特征的炎症性关节炎临床表现[3]。早期研究中描述的主要自身抗体是类风湿因子(RF)和抗瓜氨酸蛋白抗原(ACPA)的抗体[4-5]。RF/ACPA阳性患者常被定义为血清阳性患者。自身抗体的产生与多种因素相关，包括HLA-DRB1特异性等位基因与PTPN22、CTLA4、STAT4等T细胞激活相关基因，以及社会经济地位、烟草、职业性粉尘、微生物、饮食、激素等环境因素[6-14]。其中，社会经济地位通过影响饮食、微生物、粉尘等因素，起间接诱导作用。这些因素的相互作用，可使机体产生一系列特定形式的翻译后修饰肽/蛋白质，使机体对自身肽的耐受性丧失，从而产生自身抗体诱发机体自身免疫紊乱[3]。

1.1 遗传及环境危险因素的作用

RA的最大遗传风险因子位于HLA(人类白细胞抗原)复合体II类基因区域，编码HLA-DRB1分子，该基因序列即被称为HLA-DRB1特异性等位基因。HLA-DRB 1特异性等位基因可编码一个保守的氨基酸序列，位于抗原呈递分子的抗原结合槽中，这个保守序列被称为共享表位(SE)[7]。既往认为HLA-DRB 1等位基因与RA患者RF或ACPA的产生相关，且等位基因与ACPA的相关性高于RF[6]；HLA-DRB 1分子与瓜氨酸肽的相互作用可能通过多种途径影响RA的发病；例如，先前在HLA-DRB1*0401转基因小鼠中进行的一项研究表明，在抗原肽与SE相互作用的位置，将肽侧链位置的精氨酸转化为瓜氨酸会显著增加抗原肽-MHC的亲和力，并导致CD4+T细胞的激活，提示HLA-DRB1等位基因可启动对瓜氨酸自身抗原的自身免疫应答[15]。然而最近的证据表明，HLAⅡ类位点与成为ACPA+的风险无关，而与从ACPA+向ACPA+RA进展的风险有关，提示HLAⅡ类基因位点可能并不直接参与ACPA应答的形成，而是与其成熟有关，可能是通过T细胞在疾病发生前为产生ACPA的B细胞提供帮助[16]。除HLA-DRB1等位基因外，与RA相关性较强是PTPN 22基因，该基因被认为可导致T细胞和其他细胞免疫激活的阈值降低，最近的研究还表明，该基因的多态性可能导致高瓜氨酸化，因为PTPN 22可与负责瓜氨酸化的肽酶(PAD)的相互作用[14]。其他相关基因例如CTLA4、STAT4，被研究发现可能存在于与RA相关的炎症通路中[14]。即可能存在以下机制：环境因素(社会经济地位、烟草、职业性粉尘、微生物、饮食、激素等)诱导产生相关翻译后修饰肽/蛋白及相关自身抗体，HLA-DRB 1等则允许机体的自身免疫反应、活化T细胞(PTPN22、CTLA4、STAT4为常见的T细胞激活相关基因)，并引发增殖、分化及细胞因子的产生[16]。

1.2 pre-RA相关的自身抗体

pre-RA相关的自身抗体包括抗人IgG分子 Fc片段上抗原决定簇的自身抗体(RF)，以及抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)、抗氨甲酰蛋白抗体(ACarPA)和抗乙酰化蛋白抗体(AAPA)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗核周因子(APF)、异质性核糖核蛋白体(RA33/36)[17-18]。类风湿因子(RF)是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，存在于RA及其他风湿免疫病患中，甚至在5%正常人中也可出现低滴度RF。抗瓜氨酸蛋白抗原抗体(ACPA)是目前除RF外研究最多的RA相关抗体，与RA的发生、发展密切相关，遗传及环境因素(如吸烟、粉尘等)诱导机体产生瓜氨酸化蛋白/肽，机体识别这些自身抗原产生抗体ACPA。近年来，对ACPA阳性RA的发生和病因学有了重要的认识。ACPA及RF已成为诊断RA重要实验室依据。此外，抗角蛋白抗体(AKA)、抗核周因子(APF)、异质性核糖核蛋白体(RA33/36)等抗体对RA的早期诊断及预后判断有重要意义。目前有研究发现，在ACPA阴性RA患者中发现氨基甲酰化抗体(ACarPA)，这些抗体可以预测ACPA阴性RA患者更严重的临床过程，与关节损伤密切相关[17]。可以说，氨基甲酰化抗体(ACarPA)是ACPA阴性RA的独特的血清学指标。除此之外，目前也有研究在早期炎症性关节炎患者血清中检测了乙酰化波形蛋白肽的抗体即抗乙酰化蛋白/肽抗体(AAPA)[18]。

1.3 pre-RA相关炎性因子及自身免疫稳态失调

自身免疫反应多合并多种炎症因子的存在，如肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、白细胞介素-1Ra、GM-CSF，以及白细胞介素-4、白细胞介素-12、白细胞介素-17和嗜酸细胞趋化因子等，这些细胞因子在自身免疫的发生及进展中起重要作用[19]，随着病情进展，关节滑膜、肺黏膜、肠道、牙周组织、淋巴系统均可受累[2]。病情的进展，并非单有这些细胞因子的促炎作用，疾病早期研究发现，抗炎和促炎通路的失调致抗炎因子下调，也是病程进展重要因素，如促分解脂质介质通路、自主神经抗炎通路的调节失调等[20-22]。

2 pre-RA各系统/组织的局限性自身免疫紊乱

类风湿关节炎(RA)的系统性自身抗体在患者发病之前就可以检测到，并且可能起源于远离滑膜关节的部位。有越来越多的研究表明，在临床前RA阶段，局部自身免疫过程已在多个黏膜部位发生，包括口腔黏膜、肺黏膜和肠道黏膜[23]。然而，各部位是自身免疫继发损伤的早期靶点，还是导致全身自身免疫主要的触发因素，尚需进一步研究。在口腔黏膜和肺部，牙周病和吸烟等危险因素可能通过推动局部产生瓜氨酸自身抗原而促进自身免疫，及肠道微生物群改变可影响肠道促炎及抗炎失调可促进自身免疫性疾病的发展[24-26]。

2.1 口腔黏膜及牙周组织

大量研究表明，口腔黏膜，尤其是牙周组织可能是RA自身免疫的起始部位。首先，牙周炎(PD)患者的RA患病率显著增加[27]；其次，炎症牙周组织PAD酶和瓜氨酸蛋白表达升高，并在牙周炎患者的龈沟液中检测到抗CCP抗体[24]；ACPAS的阳性率与牙龈卟啉菌、牙周炎相关，并且与疾病活动度正相关[28]；重要的是，RA和PD具有共同的临床和组织炎症特征(以慢性软组织炎症为特征，可发生局部骨质破坏)，及遗传和环境危险因素(HLA-DR共享表位等位基因和香烟烟雾是RA的既定危险因素，也显示出PD的易感风险增加)[29]。

2.2 肺黏膜

吸烟是RA的一个高危因素，研究发现，吸烟与支气管肺泡灌洗(BAL)样本中的瓜氨酸含量增加有关，并产生高水平的ACPA，从而引发呼吸道黏膜及肺实质的自身免疫反应[30]。Willis及其同事的研究发现，早期RA患者的痰及有RA家族史或ACPA阳性健康者的痰中都存在ACPA/RF，在这些高危人群中，痰中自身抗体高于血清，或痰中存在自身抗体，而血清中没有自身抗体[31]。这表明ACPA等自身抗体极有可能在肺组织中生成，或者肺是自身免疫继发损伤的早期靶点。从RA的支气管和滑膜组织中鉴定出共享的瓜氨酸化肽，特别是瓜氨酸化波形蛋白，更支持了该观点，在肺部产生的自身抗体，它们可与滑膜中的自身抗原发生交叉反应[32]。因此，炎症诱导的肺组织自身抗体的产生可能直接参与了关节炎的发生。

2.3 肠黏膜

在临床前RA患者中的研究发现，患者肠道菌群发生了改变。肠道是人类体内最大的细菌定植地，有将近3磅的细菌和超过300万的细菌基因[33]。已发现，铜绿假单胞菌(Prevotella copri)，在新发RA患者的粪便样本较对照组更丰富，定植铜绿假单胞菌的小鼠对化学性结肠炎更敏感[34]。这些研究均表明铜绿假单胞菌具有促炎作用。促炎菌群的过度生长和具有免疫调节功能的保护性菌种的耗竭(如乳酸菌比例上调及嗜血杆菌物种枯竭)，导致促炎与抗炎的失调，这也可能是RA的易感因素[35]。更具体地说，有证据表明肠道细菌会影响局部促炎T细胞亚群和抗炎T细胞亚群之间的平衡，从而影响肠道免疫稳态。肠道菌群失调致肠道自身反应性T细胞活化，激活天然免疫而对自身抗原(包括关节炎相关抗原)产生免疫反应，诱导关节炎症[36]。即通过打破肠道免疫稳态，最终导致系统性自身免疫紊乱和类风湿性关节炎。

3 临床前RA滑膜的自身免疫

de Hair等[37]对RA高危个体的滑膜特征进行研究，研究对象确立为存在与RA相关的系统性自身免疫的个体(RF和/或ACPA阳性而无关节炎证据)，结果表明在临床前RA患者的滑膜组织中，未见明显的滑膜炎症；然而，滑膜T细胞的浸润可能先于临床前RA的体征和症状。在RA发病前，多没有明显的亚临床滑膜炎出现，这表明炎症细胞浸润滑膜组织是RA发病过程中相对较晚的一个过程，开始于临床症状的开始。然而，如上文所述，在关节炎发病前就可观察到全身变化，如检测RA特异性自身抗体RF和ACPA以及相关炎症因子。de Hair等[37]发现T细胞浸润滑膜可能在临床症状性关节炎发生之前，特别是CD3和CD8的表达与关节炎的发生有关，然而进一步研究发现，CD8+T细胞的存在与ACPA的存在以及ACPA的水平有关，而滑膜CD3+T细胞却与ACPA的存在无相关性，因此，这些T细胞是否针对特定的瓜氨酸肽的问题需要在未来加以解决。另有研究发现，在早期类风湿关节炎患者的滑膜中检测到与长期类风湿关节炎患者相比高度扩张的T细胞克隆，这表明T细胞浸润在疾病的早期阶段就已经开始[38]。van de Sande等[39]通过观察血清阳性临床前RA滑膜的影像学特征(研究对象为13例RF和/或ACPA阳性而无关节炎证据的高危个体)，发现自身抗体阳性者与健康对照组的MRI表现相似，滑膜亚临床炎症与RA前期血清自身抗体的出现不一致，系统性自身免疫先于滑膜炎的发展。然而，对RA动物模型的研究却发现，亚临床滑膜炎可以在临床症状和关节炎症状几周前发现，且与RA相比，临床前RA的滑膜炎多可以表现为亚临床滑膜炎或骨髓水肿，可通过影像学(MRI或超声)检测。由此推测，在临床前RA的疾病进程中，机体在自身免疫环境下出现滑膜的浸润，随着疾病进展，出现无症状(亚临床)滑膜炎、临床滑膜炎。

4 前期自身免疫紊乱如何进展为临床RA

研究可能发展为类风湿关节炎的“高危”人群和处于疾病早期阶段的人群的相关结果提示我们，RA相关系统性自身抗体与黏膜表面，特别是牙周膜、肺和胃肠道的局部自身免疫过程相关[23]。这种局部自身免疫如何进展为关节症状期，即由A～C期过渡为E～F期，需要进一步探讨。另一方面，各系统自身免疫紊乱是类风湿关节炎相关自身免疫的起始触发器，还是系统性自身免疫的局部表现，仍需进一步研究。综合目前国内外研究，总结前期RA由A～C期进展到E～F期的可能原因有：针对黏膜新抗原的抗体可与滑膜肽发生交叉反应[32]；抗原表位扩展和亲和力成熟导致滑膜炎[40]；循环免疫复合物导致关节症状[41]。此外，相关基因、环境风险因素、其他(如感染、创伤)对病程进展的有着不可忽视的影响，以及上文提及的胃肠道菌群失调、抗炎与促炎失衡等机制影响临床前疾病发展。在这里，需要特别强调“二次打击学说”，在机体已存在相关自身抗体后，机体再次承受如感染、创伤等“二次打击”，其可诱导滑膜中蛋白质的瓜氨酸化，进而导致滑膜炎发生。然而，机体从pre-RA进展到临床RA的具体机制，尚需进一步研究。

5 认识临床前RA的意义

RA是一种多发的致残性关节炎，未正确治疗的RA可导致关节畸形和功能丧失。临床前RA出现关节炎时多已存在滑膜炎症，但尚未出现骨质破坏，因此，早期诊断及治疗，对RA患者的预后尤为重要。近年来，pre-RA概念的提出，对RA的干预提供了理论依据，虽然pre-RA概念主要用于回顾研究，暂不能用于诊断分期，但可以借此建立RA风险评估模型。评估RA高危个体，制定有效的干预方案，从而降低RA的发病率[42-44]。

本文概述了临床前期RA的自身免疫紊乱的研究进展。遗传、环境因素诱导“自我肽”的产生，机体产生自身抗体，诱发机体的自身免疫紊乱；以及相关炎症因子的参与，其促进自身免疫紊乱的发展及随后的临床疾病的进展。此外，临床前期RA可在口腔黏膜及牙周组织、肺黏膜、肠道黏膜发生局限性自身免疫。临床前期RA已存在关节滑膜的自身免疫，可由滑膜的炎性浸润发展到亚临床滑膜炎、临床明确滑膜炎。然而，临床前期RA疾病进展机制仍未完全明确，前期各病程过渡的机制尚需进一步研究，这也为后期的研究提供了方向。