QX-314抑制细菌穿孔毒素和神经元TRPV1介导的金黄色葡萄球菌引发的疼痛

编者按：继2013年美国哈佛医学院Isaac Chiu 等发表了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)不依赖免疫系统的作用，而是直接激活痛觉感受器并引起疼痛(Nature 2013)的研究以来，近期Chiu 实验室继续报道了活细菌感染期引发的疼痛的机制。他们运用活的MRSA菌株、毒力调控位点以及受其调控的穿孔毒素位点突变的MRSA菌株感染小鼠，采用行为学、钙成像技术、离体多通道电生理技术探讨了活细菌感染期引起的自发痛和热痛敏的分子机制；并证明了QX-314，一种不通透细胞膜的钠离子通道阻滞剂可以在细菌感染时由穿孔毒素引起的孔道带入伤害性感受器起到镇痛作用。这一研究成果除了揭示了细菌感染期导致的自发痛和热痛敏的分子机制以外还证明了QX-314可以作为治疗细菌感染引起的疼痛的有效药物。

1.研究背景

疼痛是一种不愉快的感受，它是机体针对外界的有害刺激做出的保护性的反应。慢性痛则是神经系统对炎症和损伤作出的不适应性反应。随着目前吗啡滥用问题的日趋严重，对炎症痛和神经病理性痛的机制进行深入探索尤为重要。细菌、病毒和真菌等病原体感染常常引起疼痛，包括自发性的防御反射和痛觉过敏。然而由活体病原菌入侵和细菌感染导致的疼痛机制目前还不清楚，针对病原菌引起的疼痛也还没有相应的措施。

炎症和感染可以降低局麻药比如利多卡因的药效，主要是通过结合神经元膜以及使细胞酸化来中和局麻药的作用。而非甾体消炎镇痛药因为可以降低免疫系统对抗病原菌的能力而作为某些细菌感染的禁忌药。因此，寻找既能治疗疼痛又不影响宿主的抵抗力的镇痛药非常必要。

革兰氏阳性病原菌—耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 是导致人们皮肤和软组织感染的首要病因，可以产生疼痛性疖肿、脓肿、骨髓炎和蜂窝组织炎。MRSA菌株在社区和医院的感染率越来越高，抗生素耐药性的问题日益受到关注，因此需要新的方法来治疗MRSA感染。MRSA产生许多毒性因子，包括对细菌在宿主中传播和存活起关键作用的三种分泌性穿孔毒素(PFTs)：alpha-溶血素(Hla)、酚溶性调质(PSMs)和双组分白介素(HlgAB)。作者近期的研究发现MRSA通过N-甲酰化多肽和Hla可以使感觉神经元钙离子内流而直接激活神经元，导致不依赖于免疫系统的疼痛(Nature 2013)。与野生型MRSA相比，Hla突变体引起的热和机械痛敏降低。虽然这些结果有助于了解疼痛的潜在分子机制，但以往的研究并没有涉及活的病原体入侵过程中所产生的疼痛，也就是说活细菌感染过程中产生的自发性疼痛机制还并不清楚。

该研究阐明了MRSA的毒力决定因子agr以及对PFTs的调控是感染过程中激活神经元的关键机制。除了以前就证明的Hla之外，该研究还发现了另外一些PFTs，比如PSMs和HlgAB，都能使小鼠产生疼痛；这些毒素还能直接诱导神经元钙离子的内流和动作电位的爆发；MRSA感染过程中的自发性疼痛依赖于agr和Hla；而DRG神经元的TRPV1阳离子通道介导感染过程中的热痛觉过敏；QX-314可以抑制PFTs诱导的神经元活化，既能长期阻断疼痛又不影响MRSA感染过程中宿主对细菌的清除力。总之，该研究阐明了MRSA感染过程中产生疼痛的几种分子机制，证明QX-314是一种有效的阻断感染引起的疼痛的镇痛药物。

2.主要研究方法

本文作者采用活的MRSA菌株USA300、USA500、纽曼菌株、毒力调控基因位点突变(△agr)的USA300以及三类PFTs各个位点突变的USA300菌株感染C57BL/6小鼠，然后检测自发痛，机械痛、热痛及脚掌的肿胀程度。以钙成像技术检测细菌是否直接激活DRG神经元并引起钙内流。采用离体多通道记录技术检测被感染小鼠DRG神经元的放电情况，进一步分析PFTs中的哪个因素对疼痛是必要的。使用药理学方法将RTX及QX-314注射于小鼠，观察TRPV1感受器失活后自发痛及热痛的变化，及QX-314对于痛行为及神经元放电的影响。

3.主要研究结果

为了研究感染过程中的疼痛，作者在小鼠脚底皮下注射不同剂量的USA300 (5×106- 5×108CFU)，一种毒性很强的社区获得性MRSA，也是美国皮肤和软组织感染的主要病原菌。观察细菌感染后1 h内小鼠自发性抬脚、舔爪和抖脚等自发痛行为，小鼠的这些行为被认为可以代表人严重细菌感染后立即出现的自发痛和锐痛。高剂量USA300感染可在数分钟内诱发强烈的自发痛行为，20～30 min达到高峰，持续60 min。低剂量不会引发自发痛。高温灭活的细菌感染后不产生自发痛，说明自发痛依赖于活的病原体。各个剂量的细菌均会产生机械痛和热痛。机械痛和热痛4～6 h达高峰，低剂量USA300引起的机械痛持续时间较长(120 h)，高剂量持续时间短(24 h)。而热痛正好相反，低剂量持续时间较短，高剂量持续时间长。脚爪肿胀和损伤程度也和细菌接种量有关。以上结果提示，MRSA感染可引起即刻的、剂量依赖性的自发痛以及持续数天的机械痛敏和热痛敏。

随后，作者比较几种MRSA感染后产生疼痛的能力。两种流行的MRSA菌株USA300和USA500感染后均产生了显著的、程度相似的自发痛，但对甲氧西林敏感的纽曼菌株，其表达的毒力因子水平低于前两种菌株，产生的自发痛程度与对照的PBS组无差别。这些数据表明疼痛可能与毒力因子的表达有关。而如果把毒力因子agr基因位点突变，(△agr) USA300引起的自发痛则消失，但是小鼠组织的细菌扩增量相同。表明由agr决定的细菌毒力而不是细菌扩增水平影响了自发痛。为了检测MRSA是否直接激活神经元，用原代培养的DRG神经元进行钙成像实验。USA300与原代DRG细胞共培养15 min引起了强烈地钙内流，许多细菌激活的神经元也可被辣椒素（TRPV1激动剂）激活，说明这些神经元是伤害性感受器神经元。激活的神经元的百分比与细菌浓度成量效关系，高浓度的细菌激活了将近100%的神经元，而由突变的Δagr USA300激活的神经元明显减少，说明MRSA激活神经元的能力依赖于agr，而agr介导了MRSA感染引起的自发痛和神经元的钙内流。

PFTs决定了细菌在宿主组织内的毒性，而agr系统是MRSA表达PFTs的主要调控因子。MRSA产生三类PFTs，包括：Hla，PSM和HlgAB。为了验证伤害性神经元上是否表达PFTs受体，作者分析了不同DRG神经元亚群，包括IB4+/Nav1.8+，IB4-/Nav1.8+和Parvalbumin+细胞的转录组数据。发现神经元上表达Hla，HlgAB和PSM的受体（它们分别是Adam10，Darc和Fpr2）。那么MRSA的PFTs是否可以直接诱导神经元放电呢？作者通过多电极阵列技术发现Hla，PSM和HlgAB均能引起神经元放电。Hla，PSMα3和δ毒素（另一种PSM）注射小鼠体内产生剂量依赖性的自发痛行为。而无法聚集成孔的单一组分HlgA，则不会产生疼痛。为了排除毒素造成的细胞溶解引发的放电，将神经元培养基与三种PFTs以及活的USA300共孵育15 min后观察乳酸脱氢酶(LDH)的释放，结果并没有观察到(LDH)显著释放，说明没有细胞毒性的产生。以上结果表明三种不同类型的MRSA的PFTs (Hla，PSMα3和HlgAB)都足以迅速地使神经元产生动作电位，并使小鼠产生自发痛。

为了检测不同的PFTs在MRSA引起疼痛中的必要性以及它们是否在疼痛中扮演特定的角色， 研究者使用不同的突变PFTs细菌检测疼痛。研究发现单独突变HlgAB不影响自发痛，但是将Hla和HlgAB一起突变或单独突变Hla都明显抑制自发痛，突变Hla的USA300所引起辣椒素反应阳性神经元也明显减少。单独突变PSMs 的某一位点(△psmα△psmβ△hld)并不影响自发痛，如果突变所有的PSMs有降低自发痛趋势但是影响也比较小。组织肿胀程度都与突变没有关系。以上数据证明了依赖于agr的PFTs (Hla, leukocidins, PSMs)可以直接诱导神经元活化，并使小鼠产生自发痛。然而在活的细菌感染期间，只有Hla是必须的。

痛觉过敏发生较自发痛晚，持续时间却长于自发痛。作者又对MRSA感染引起痛觉过敏的分子机制进行了研究。结果发现感染突变agr的USA300，小鼠机械痛敏和热痛敏并不受影响。TRPV1是一种由伤害性感受器表达的离子通道，可以被伤害性的热激活，是炎症性疼痛中热痛过敏的关键介质。为了证明TRPV1对MRSA感染引起的痛觉过敏的作用，使用树酯毒素(RTX)处理小鼠，RTX可以去除TRPV1神经纤维和神经元。经RTX处理的小鼠自发痛和热痛明显减少，机械痛敏则不受影响，这表明机械痛敏可能是由其他感觉神经元亚群所介导。TRPV1基因敲除小鼠 的MRSA热痛觉敏感明显降低，机械痛和自发痛没有变化。这些结果表明，表达TRPV1的伤害性感受器对于自发痛和热痛敏是必要的，而TRPV1离子通道则仅仅参与MRSA感染引起的热痛敏的形成。

鉴于PFTs是感染过程中疼痛发生的关键介质，作者希望根据这一机制找到有效的镇痛方法。QX-314是一种带正电荷的电压门控钠通道抑制剂，通常不能通透细胞膜。之前的研究表明，QX-314分子比较小，在大孔道阳离子通道打开时可以被送进伤害性感受器中从而产生长时程的镇痛作用。那么细菌引起的疼痛和神经元的激活导致神经元细胞膜孔道的开放是否可使QX-314进入伤害性感受器，阻断动作电位的产生、抑制疼痛呢？实验发现Hla和PSMα3可引起DRG神经元强烈的放电，应用QX-314后可直接抑制动作电位的增加，说明QX-314可以进入神经元。行为实验也进一步验证了QX-314通过PFTs产生镇痛作用。小鼠先注射Hla，然后15 min后注射2% QX-314，结果显示自发痛行为明显减少。以上结果说明了QX-314能强烈地抑制由MRSA的PFTs引起的神经元放电和自发痛反应。

最后，作者研究了QX-314是否可以阻断USA300活细菌引发的疼痛并且比较了QX-314和其它镇痛剂的效果。 因为QX-314是利多卡因的一种衍生物，作者首先比较了QX-314和利多卡因在治疗MRSA引起的疼痛方面的疗效。虽然利多卡因和QX-314 均明显抑制MRSA引起的自发痛，QX-314还显著性地抑制机械痛敏和热痛敏，而利多卡因则对机械痛敏和热痛敏完全无效。QX-314应用于Trpv1基因敲除鼠，机械痛敏仍然可以被抑制，提示QX-314可能通过其他的机制进入神经元。另外一种临床上广泛应用的非甾体消炎镇痛药布洛芬可通过抑制环氧化酶介导的前列腺素的合成治疗炎症性疼痛。然而它对细菌引起的疼痛的疗效尚未明确。两种剂量的布洛芬，包括人类最大推荐剂量(40 mg/kg)，均不能阻断小鼠MRSA感染后的机械痛敏。由于利多卡因和布洛芬镇痛效果不佳，QX-314有希望应用到临床治疗感染性疼痛，且实验结果表明QX-314每次注射后均能产生有效地并长达数小时的镇痛作用。此外QX-314并不影响小鼠感染后的细菌负荷情况，表明镇痛并不会消减宿主抵抗MRSA的能力。这些数据都表明QX-314是治疗感染性疼痛的有效方法。

4.讨论

疼痛是许多细菌感染如皮肤脓肿、龋齿和尿道感染的特征之一。然而，很少有研究探讨活病原体侵袭过程中产生疼痛的分子机制。该研究结果表明，MRSA的几种类型的PFTs可通过直接诱导神经元钙内流和动作电位发放产生疼痛。鉴于这些毒素在细菌病原体中普遍存在，它们可能是细菌感染期间引起疼痛的一种基本机制。

由于利多卡因镇痛作用容易被感染和炎症所中和，因此开发治疗感染期间的疼痛的方法非常有必要。该研究发现利多卡因对MRSA诱导的机械或热痛敏没有影响，布洛芬即使在最大推荐剂量(40 mg/kg)下，对MRSA引起的疼痛也没有影响，而QX-314能立即阻滞由PFTs引起的神经元激活，并能即刻并长时程地抑制MRSA引起的自发痛和痛觉过敏。

人们常常用小鼠来研究各种MRSA感染（如皮肤感染、肺部感染、菌血症）的发病机制。在本文献中作者使用皮下注射MRSA皮肤感染的小鼠模型（代表人类蜂窝织炎或脓肿的形成）来研究感染引起的疼痛，对于具有免疫能力的小鼠来说，通常需要大量的细菌才能引起皮肤感染（1×107-1×109CFU），而在人类中，较小的接种量可能导致严重的感染。在这个实验中使用的细菌的接种量与其他报道是一致的。使用小鼠感染模型有一些注意事项，包括白介素受体的物种特异性差异（例如，C5a受体在小鼠中不与PVL结合），以及分泌的抑制人类先天防御系统的金黄色葡萄球菌因子之间的非相关性。尽管有这些警示，这项研究中证实的疼痛机制仍然可能与人类感染期间的疼痛机制相关。而且这项研究模拟的是急性MRSA皮肤感染，人类皮肤慢性感染（如特应性皮炎） 是否可能具有类似的神经元激活机制仍需要在今后的研究中得到证实。

活病原菌感染产生的自发痛反应可能代表了病人在感染期间所经历的剧痛，尤其是在细菌负荷最高的感染高峰期。为了观察这一现象，作者使用大剂量的MRSA（5×108CFU），但该剂量仍在引起皮肤感染模型的细菌使用范围之内。实验期间(60 min)大量的细菌局部集中引起的毒素浓度与入侵高峰期相似。此外，自发痛发生在15 min内，这个时间段小鼠对疼痛没有适应，可以在不同的小鼠上得到一致的实验结果，而30 min后小鼠的自发痛下降它们会出现间歇性睡眠。尽管有以上这些需要注意的地方，但作者认为这项实验仍然可以帮助我们明确细菌感染介导自发痛的关键因素。

agr是一种调控PFTs表达的毒性决定基因，它对感染过程中的自发痛至关重要，这与高水平的毒性因子会诱发疼痛的假说相吻合。该实验发现三种 类 型MRSA的PFTs，Hla、HlgAB和PSMs可以直接诱导神经元放电和疼痛。Hla和HlgAB以单体的形式分泌后停靠在细胞膜上，寡聚形成孔洞，允许阳离子进入哺乳动物的细胞中。PSM是肽类PFTs，同样也会诱发钙内流，但PSM形成的孔隙结构尚未完全阐明。哺乳动物宿主细胞识别PFTs后会启动自噬和其他修复机制，由于膜的修复使得形成的孔隙时间比较短，在关闭前允许一些阳离子进入，这一过程可以解释MRSA不同的PFTs诱导的神经元放电动力学的差异。鉴于PFTs溶解细胞的性质，探讨感染是否会导致伤害性感受器神经终末的永久性损伤或神经元的失活，从而导致长期疼痛将是很有趣的。

MRSA的PFT之间的相互作用也可能导致疼痛。Berube等人发现缺乏PSM USA300 （特别是PSMα和Hld突变体）的细菌3 h内产生的Hla明显减少，但6 h可以恢复至正常水平。作者选择的细菌接种时间可能正好在这两个时间点之间，因此观察到PSM缺陷菌株产生的自发痛有下降的趋势，但与PBS组无差异，这一现象可以用USA300产生的Hla下降来解释。

该实验还证实在活的MRSA感染期间有不同的痛行为（自发痛、热痛敏和机械痛敏）产生。TRPV1离子通道在细菌感染的过程中介导热痛觉过敏，而不是自发痛。TRPV1能够识别伤害性热、辣椒素和质子(H+)，细菌感染引起酸中毒，质子可直接激活TRPV1；细胞因子通过磷酸化级联反应介导TRPV1的致敏；细菌前驱酶、氧化介质和免疫细胞在炎症过程中释放的细胞因子都可能介导TRPV1致敏，还有一些其他的介导 TRPV1致敏的机制还需要进一步研究，同时作者还没有考虑到在感染过程中其他离子通道或受体的参与。

QX-314是一种不通透膜的带正电荷的钠通道阻滞剂。实验发现 QX-314能有效抑制MRSA引起的自发痛和痛觉过敏。以往研究证实TRPV1和TRPA1这些阳离子通道的开放形成的瞬态孔隙可以将QX-314送进伤害性感受器中。最近，纪如荣实验室发现鞭毛蛋白，细菌激活A纤维神经元的一种成分，联合QX-314治疗可以缓解神经病理性疼痛。TRPV1的内径约 6.8Å，足够让QX-314通过，而由PFTs形成的孔道比TRPV1大(Hla: 15Å34；leukocidins: 20-30Å49)。未来的工作将探索QX-314在细菌感染期间进入神经元的确切机制。尽管作者还没有确定这些机制，但QX-314对疼痛有高效、持久的抑制作用这一发现很重要。

穿孔毒素是除MRSA外许多细菌病原体的主要毒性因素。但PFTs是否与其他致病菌产生的疼痛机制有关需进一步的证实。作者实验室的工作证明了PFTs的长度和大小是不相关的，因为大的beta-桶状毒素(Hla，HlgAB)和短的两亲性肽毒素(PSMs)都可以引起神经元放电和疼痛。鉴于PFTs是一种具有高度破坏性的药物，伤害性感受器会感知它们的存在，这可能是一种重要的机制去警告宿主病原体的存在。

炎症性疼痛的临床前研究通常使用完全弗氏佐剂或卡拉胶，但这不能代表人类疼痛的病理生理学诱因。细菌脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白和来源于真菌的酵母聚糖注射后都容易引起感染，然而，病原体除了这些成分外，还产生许多毒性因子，其中有一些不易纯化、合成或储存（例如热不稳定毒素），因此，研究活的病原体感染引起的疼痛机制，以及研究感染状态下镇痛药的疗效是很有必要的。一些课题组已经开始了这项工作。Klumpp等研究表明，尿路致病性大肠杆菌产生的盆腔超敏反应依赖于脂多糖和TRPV1。Farmer等人证实了经阴道反复感染的白色念珠菌会导致小鼠出现强烈的机械异位性疼痛。

总之，本研究探讨了几种活的MRSA细菌感染产生疼痛的关键分子机制；并认为QX-314是一种有效的镇痛药物，可以在感染期间抑制自发痛、热痛敏和机械痛敏。