基质金属蛋白酶及其基因多态性在缺血性卒中病理过程中的作用

张敏，马丽，赵咏梅，吕燕敏，龙会登，庞丽娟

卒中是全球死亡和残疾的主要原因之一。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）9是MMP家族的成员，因其对脑血管基底膜主要成分如Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白的降解作用，已被证明在脑血管疾病的发生和发展中发挥重要作用[1]。此外，研究证实MMP9还参与了缺血性卒中后脑损伤、再灌注损伤的病理过程。因此，进一步探究MMP9及其基因多态性在缺血性卒中发病、进展及预后中的作用，对缺血性卒中的诊疗具有重要意义。

1 缺血性卒中后MMP9的表达及来源

缺血性卒中后，MMP9被发现在梗死区脑组织及相关细胞中高表达。动物实验证实，与假手术小鼠相比，大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠缺血灶中MMP9显著增加，并推测MMP9的升高可能与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）升高有关[2-4]。大鼠实验显示，在脑局灶性缺血24 h内，梗死区中心及外周的内皮细胞和中性粒细胞表达MMP9，且MMP9活性最高，并在5 d内维持该活性水平。5 d后，可观察到梗死区巨噬细胞表达MMP9；15 d时，MMP9活性降至基线状态[5]。也有研究证实，在大鼠发生脑缺血后1～3 d，纹状体和皮质中央缺血区域内可检测到MMP9增加，且其主要位于内皮细胞中，在神经元和星形胶质细胞中表达较弱；相反，在卒中后7～14 d，MMP9主要在梗死区周围皮层的神经元和星形胶质细胞中表达[6]。

使用嵌合体野生型（wild-type，WT）→MMP9敲除（MMP9-/-）小鼠（将WT小鼠的骨髓移植到MMP9-/-小鼠）或MMP9-/-→WT小鼠（MMP9-/-小鼠的骨髓移植到WT小鼠）的研究显示，MMP9前体（pro-MMP9）仅在WT或WT→MMP9-/-小鼠脑缺血再灌注24 h时强烈升高，活性MMP9在WT小鼠和WT→MMP9-/-嵌合体小鼠中水平相似，考虑野生型小鼠短暂性局灶性脑缺血24 h内的MMP9表达来源于白细胞[7]。有研究将短暂性MCAO（2 h）再灌注小鼠循环血中的中性粒细胞分离后发现，WT小鼠和WT→MMP9-/-嵌合体小鼠可以显示MMP9前体，但在MMP9-/-和MMP9-/-→WT小鼠的中性粒细胞中却未发现MMP9前体显像，提示脑缺血再灌注后MMP9前体来源于中性粒细胞[7]。研究者们进一步发现在中性粒细胞分泌颗粒里含有大量的MMP9前体，而缺血性卒中后这些分泌颗粒释放并激活MMP9[8-10]。

中性粒细胞释放MMP9，MMP9反过来可促进中性粒细胞黏附与聚集。与MMP9-/-小鼠相比，短暂性MCAO（2 h）的WT小鼠缺血灶内小静脉内皮在24 h就出现白细胞黏附，同时中性粒细胞浸润明显增加；再灌注8 h和24 h，缺血半球中性粒细胞堵塞毛细血管和实质内中性粒细胞浸润的程度逐渐增加[7]。

MMP9在缺血性卒中患者中也呈高表达。Anna Rosell等[11]解剖了缺血性卒中（发病5 d内）患者死亡6 h内的新鲜脑组织，发现梗死灶中MMP9前体及激活的MMP9表达较梗死灶周围组织高，而梗死周围组织MMP9前体及激活的MMP9表达则高于对侧正常脑组织；梗死灶中MMP9主要位于中性粒细胞高表达的血管周围；梗死灶内MMP9阳性细胞主要为激活的小胶质细胞，而梗死灶周围MMP9阳性细胞主要为激活的小胶质细胞和中性粒细胞。另外有研究者对发病9 d至5年死亡的缺血性卒中患者进行尸体解剖，但在其脑组织中未检测到MMP9的表达，提示MMP9主要在缺血性卒中急性期被释放和激活[12]。

2 缺血性卒中与外周血MMP9水平的关系

Mark A.Reynolds等[13]比较了健康对照组与发病12 h内卒中（出血性和缺血性）患者的血浆MMP9水平，发现急性卒中患者血浆MMP9的水平显著高于对照组。Solveig Horstmann等[14]测定了50例急性缺血性卒中患者的血清MMP9水平，发现MMP9水平在发病第1天急剧增加，并持续升高至12 d。也有研究显示，外周血基线MMP9水平升高与缺血性卒中颅脑CT超急性期的征象（与临床表现相符的局部低密度灶，豆状核、皮质显影模糊，皮层沟消失或中线结构移位而导致的占位效应）有关，但与最终的脑梗死体积无关[15]。另有研究显示，在大脑中动脉闭塞后3 h内接受rt-PA治疗的患者，血浆基线MMP9水平与溶栓前的MRI DWI上的病灶体积无关，但与rt-PA治疗后第一个24 h内DWI上病灶的增长相关，基线MMP9＞100 ng/mL为DWI病灶增长＞180%的最佳预测点；而且该研究还显示，基线MMP9水平与缺血性卒中患者溶栓治疗前的NIHSS评分无关，但与治疗后第一个24 h内较差的NIHSS评分有关，MMP9水平对缺血性卒中超早期脑损伤有独立预测作用[16]。

虽然目前多数研究证实外周血MMP9表达水平升高增加与缺血性卒中关系密切，但也有临床研究的结论不一致。一项大型病例对照研究评估了MMP9的遗传变异与心肌梗死和卒中风险间的关系，结果显示MMP9单倍型或单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与心肌梗死和卒中无关[17]。一项包括1308例患者的前瞻性、多中心观察性研究显示，血浆MMP9水平在卒中和假卒中患者之间或者在超急性期中缺血性卒中和出血性卒中患者之间并没有区别[18]。因此，MMP9对缺血性卒中的影响仍需进一步的证据支持。外基质成分和MMP活性蛋白的多功能蛋白，其表达在缺血脑组织中上调，可以增加MMP9 mRNA的表达并激活MMP9[20]。白细胞介素17（interleukin17，IL-17）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）可以通过p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2依赖的核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）和活化蛋白-1（activated protein，AP-1）诱导MMP9的表达[21-22]。IL-1β则可通过NF-κB、p42/p44MAPK、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途径诱导MMP9表达[23]。心血管活性肽（Salusin-β）可通过p65-NF-κB通路促进MMP9的表达，进而导致血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）由血管中膜向内膜迁移及内膜增生[24]。此外，有学者研究发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促进MMP9的表达，且MMP9水平与VEGF水平在缺血性卒中急性期呈正相关[25]。R.D.BELL等[26]发现载脂蛋白E4（apolipoprotein E4，APOE4）的表达可通过激活小鼠周细胞中的促炎亲环蛋白A（cyclophilin A，CypA）-NF-κB-MMP9途径导致血脑屏障分解，而星形胶质细胞分泌的APOE3可通过脂蛋白受体抑制周细胞中CypA-NF-κB-MMP9通路[26]。

3 MMP9参与缺血性卒中病理生理过程的相关通路

MMP9可通过多种途径被激活或者抑制。在脑缺血时，MMP9可与神经元型一氧化氮合酶共定位，并在体内被S-亚硝基化激活，最终诱导神经细胞凋亡[19]。聚合酶δ-相互作用蛋白2（polymerase δ-interacting protein 2，Poldip2）是一种调节血管细胞

4 MMP9与缺血性卒中出血转化的关系

基于对细胞外基质的降解作用，MMP9可导致缺血性卒中后出血转化。在大脑中动脉区心源性卒中患者中，无论有无出血转化，患者外周血MMP9表达均增加，在后来发展为实质出血的患者中，MMP9的血浆水平显著升高[27-28]。另有研究者发现，在调整了潜在的危险因素及梗死体积后，外周血MMP9升高（MMP9≥140 ng/mL）与发病24 h内急性缺血性卒中患者出血转化的发生密切相关。无论是大动脉粥样硬化型、心源性栓塞型还是不明原因型缺血性卒中，外周血MMP9的高表达均是患者发生出血转化的独立预测因素，其预测出血转化的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为87%，90%，61%和97%[15]。对卒中后5 d内死亡的患者死亡后6 h内进行尸检，发现MMP9在出血转化病灶中高表达且其信号强度高于梗死灶及梗死灶周围[11]。

rt-PA被证实可促进MMP9的表达。动物实验证实，与对照组相比，rt-PA处理的MCAO小鼠脑组织中MMP9的活性增加[2]。临床研究发现，相对于没有出血转化的患者，发病3 h内rt-PA溶栓并出现治疗相关的出血性转化或实质血肿的急性缺血性卒中患者基线MMP9水平显著增高[29]。富含于人脑内皮细胞中的低密度脂蛋白受体相关蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）可通过MMP9基因启动子中含有的AP-1和NF-κB结合位点介导rt-PA引起的MMP9的上调[30]。rt-PA还可以通过一条独立于其蛋白水解活性的途径诱导LRP-1亚基上的快速酪氨酸磷酸化，然后激活MAPK/Erk激酶1及其下游的Erk-1和Erk-2来诱导MMP9的表达[31]。在一项纳入了300多例急性缺血性卒中患者（NIHSS中位数为11）的研究中发现，外周血MMP9水平变异[（治疗后24 h MMP9-治疗前MMP9）/治疗前MMP9]与死亡或症状性颅内出血独立相关，且MMP9水平变异与缺血性卒中后3个月的不良功能结局相关（mRS≥3分）；在排除了较轻微的出血转化患者后，MMP9水平变异与溶栓后症状性颅内出血仍密切相关；该研究还显示，无论是溶栓前、溶栓后24 h还是溶栓后7 d，外周血MMP9水平变异均与较高的NIHSS评分相关[32]。Solveig Horstmann等[14]比较了卒中患者的3个治疗亚组：静脉注射肝素（n=18）组，中度低温（n=15）组和rt-PA静脉溶栓（n=17）组，发现外周血MMP9水平在不同治疗组显著不同，其中，溶栓亚组中最高，亚低温组中最低。MMP9的增加可能与rt-PA介导的中性粒细胞黏附和脱颗粒有关[33]。

5 MMP9基因多态性与缺血性卒中的关系

MMP9的基因多态性rs3918242（-1562 C/T）位点基因多态性，与缺血性卒中的关系也被大量研究所证实，但结果却不尽相同甚至相反。有研究显示，相对于MMP9 rs3918242位点的TT基因型，携带CC基因型和TC+CC基因型的人群有更高的缺血性卒中的发病风险；且CC基因型和TC+CC基因型与中国缺血性卒中分型（Chinese Ischemic Stroke Subclassification，CISS）中大动脉粥样硬化亚型的卒中风险相关[34-35]；但另有研究证实，具有rs3918242 T等位基因的缺血性卒中特别是有吸烟史的缺血性卒中患者，血清MMP9水平明显升高，且较CC基因型者具有更大的梗死面积[35]。卒中患者MMP9 rs3918242位点 T等位基因和CT+TT基因型频率显著高于健康人；相对于CC基因型的卒中患者，T等位基因携带（CT+TT基因型）的患者更年轻；在校正了年龄、性别、BMI和血脂等混杂因素后，T等位基因和TT基因型与卒中的发生密切相关；而且相较于无2型糖尿病的卒中患者，有2型糖尿病的卒中患者中T等位基因和CT+TT基因型更多见[36]。

一项Meta分析显示，MMP9 rs3918242位点变异（T等位基因，TT+CT基因型）增加中国人群中缺血性卒中的风险；然而两者在高加索人群中未检测到有关联性[37]。新近发表的一项纳入3647例缺血性卒中患者和3685例正常对照的Meta分析也取得了相似的结果[38]。而日本的一项纳入3094例2型糖尿病患者的研究显示，MMP9 rs3918242位点T等位基因与2型糖尿病患者卒中发病率无关；但该研究进一步将与血栓形成和动脉粥样硬化斑块破裂相关的4种基因——MMP9 C-1562T、血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）G-1051A、凝血因子Ⅻ（coagulation factor Ⅻ，F12）C-46T、纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor，PAI-1）6754G/5G按各自的基因多态性分为8组（每位患者携带的上述等位基因的数量从0至8），比较基因多态性与卒中的关系后发现，随着不良等位基因数量的增加，缺血性卒中患病率增加；在调整了性别、年龄、吸烟习惯、BMI、糖尿病患病时间、糖化血红蛋白、高血压和血脂异常等因素后，两者仍显示有密切联系；而且与具有3个或更少等位基因的患者相比，具有4个或更多等位基因的患者发生缺血性卒中的风险显著增加[39]。

有研究证实，MMP9基因型多态性与rt-PA治疗后出血转化无关[40]。J.Montaner等[28]对发病3 h内，责任血管为大脑中动脉并行rt-PA溶栓的缺血性卒中患者进行了研究，结果显示，MMP9启动子区C-1562T基因多态性在患者与健康对照组之间或后来发生出血转化的患者之间无显著差异。

6 展望和建议

①多种因子和通路均可导致缺血性卒中后MMP9表达的升高，但目前研究的结果和结论存在一定差异甚至矛盾，因此对于相关通路和机制的研究有待于更加深入。②MMP9可来源于白细胞并可促进白细胞的黏附与聚集，导致脑毛细血管堵塞及局部的炎症反应，调节性T细胞则可降低MMP9的表达，而相关研究证实CD4 T淋巴细胞对动脉粥样硬化的发生发展有促进作用，CD8 T淋巴细胞则延缓和改善动脉粥样硬化的形成。淋巴细胞与MMP9的关系有待于进一步研究证实。③血浆MMP9水平及MMP9基因型与缺血性卒中之间的关系有相互矛盾的结果且在不同人种中亦有差异，因此MMP9在更大样本，更多人种中的研究有待于进一步开展。④基于MMP9对细胞外基质的降解和重塑作用，MMP9及其抑制剂在缺血性卒中后血脑屏障破坏及出血转化中作用的研究应进一步加强。

目前研究表明MMP9在缺血性卒中发病中具有重要作用。MMP9水平升高与神经元损伤，细胞凋亡，血脑屏障开放，脑水肿，出血性转化和卒中后再灌注损伤均密切相关[19，27-28，41]。卒中后早期抑制MMP9的表达可以延缓卒中的进展，降低卒中后脑水肿程度及出血转化的风险及再灌注损伤，减轻神经血管损伤并改善神经功能[42-44]。但也有一些临床研究显示MMP9与卒中的发生发展没有关系[17-18]。因此，MMP9在卒中发病、进展及预后中的作用及其机制需要进一步的证据支持。

【点睛】本文对基质金属蛋白酶9在缺血性卒中后的激活，参与脑损伤的可能机制，其基因多态性与卒中及卒中后出血转化的关系研究进行了总结。