人参皂苷Rg1促进C2C12细胞增殖与分化

徐国超，高 岩，马 爽，贾胜男，邱 晴，王 钰，霍洪亮

(1.长春市职业技术学院基础教育学部，吉林 长春 130033；2.东北师范大学生命科学学院，吉林 长春 130024；3.东北师范大学环境学院，吉林 长春 130117)

骨骼肌是构成人体结构的重要组成部分，具有维持躯体姿势、产生躯体运动和参与能量代谢等多种生理功能[1-3].在躯体运动过程中或者某些病理条件下，骨骼肌容易受到损伤或者产生代谢障碍[4-5].骨骼肌属于终末分化细胞，不能进行补偿性增殖，损伤后只能通过蛋白质合成调控和骨骼肌卫星细胞的增殖与分化进行修复[6-7].人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分之一，[8-9]具有抗癌、抗辐射和抗衰老等功能[10].有关人参皂苷Rg1对骨骼肌发育、增殖和分化调控作用的报道较少.为此，本文探讨了人参皂苷Rg1对骨骼肌增殖、分化的影响，本研究对开展受损骨骼肌治疗与修复，提高骨骼肌机能具有重要的临床意义.

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基(美国GIBCO公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；胰蛋白酶(北京鼎国生物公司)；胰岛素样生长因子-1(IGF-1，武汉艾美捷公司)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Cat#P1200，北京索莱宝生物公司)；单克隆抗兔MyoG抗体(英国Abcam公司)，单克隆抗鼠MyHC抗体(英国Abcam公司)，单克隆抗鼠β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物公司)；二甲基亚砜(DMSO，北京鼎国生物公司)；人参皂苷Rg1(上海源叶生物公司)；细胞活性测定试剂盒(美国Sigma公司).

1.2 细胞系

小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12细胞 (美国模式菌种收集中心).

1.3 噻唑蓝比色法(MTT)

收集C2C12细胞，按照10 000个/mL的密度取200 μL接种于96孔板内，并置于培养箱中培养.细胞完全贴壁后，弃掉细胞培养液，更换无血清培养基处理12 h.按照空白组、不同浓度人参皂苷Rg1组分别处理48 h，加入20 mL 0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h.每孔加入150 μL DMSO，摇床震荡10 min.待MTT-甲臜结晶充分溶解，酶标仪检测D(490)值.

1.4 流式细胞术

C2C12细胞按1 000 000个/mL的密度接种于6孔板中，细胞完全贴壁后，更换无血清培养基培养12 h.按空白组、IGF-1处理组和人参皂苷Rg1处理组培养48 h，加入EDU试剂(10 μmol/L)处理4 h.按照EDU检测试剂盒说明，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液洗涤细胞.用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞.用含4%多聚甲醛的PBS缓冲液重悬细胞，室温避光孵育15 min.用含1% BSA的PBS缓冲液再洗涤细胞，收集细胞加入EDU反应混合物中，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测.

1.5 蛋白质印迹法

将C2C12细胞超声破碎，分别加入磷酸酶抑制剂A和B，4℃条件下16 000 r/min离心10 min.吸取上清100 μL移至EP管中，加入等量SDS-PAGE蛋白上样缓冲液.沸水煮蛋白样品5～10 min，使蛋白变性.上样，120 V电泳30 min.取出凝胶，蒸馏水冲洗.取与凝胶大小相同的PVDF膜，在甲醇中润湿，以1张海绵、3张滤纸、凝胶、1张PVDF膜、3张滤纸、1张海绵平放并夹紧，置于冰盒中，加入冷转膜液800 mL，连通电泳仪，100 V恒压处理1 h.转膜结束之后，将PVDF膜放入封闭液中，4℃封闭过夜.封闭过后的PVDF膜用TBST缓冲液漂洗3次，加一抗孵育2 h.TBST漂洗3次，加二抗，孵育1 h.用TBST漂洗3次.将印迹膜蛋白在全自动显影仪中显影.利用Image Pro Plus6.0软件进行半定量分析.

2 实验结果

2.1 细胞活性

人参皂苷Rg1孵育C2C12细胞48 h后，用10×20倍显微镜观察、拍照，结果见图1.由图1可见，与空白组相比人参皂苷Rg1处理组细胞明显增多.利用MTT比色法检测细胞活力，结果见图2，与空白组相比人参皂苷Rg1处理组D(490)值呈浓度依赖性增加，并在浓度为0.01 mmol/L时达到最高，表明人参皂苷Rg1能够促进C2C12增长并提高其活性.

a空白；b—e分别为0.0001，0.001，0.01和0.1 mmol/L人参皂苷Rg1处理，下同

图2 MTT比色法检测细胞活性

2.2 细胞增殖率

胰岛素样生长因子(IGF-1)对成肌细胞具有良好的促增殖作用.以IGF-1作为阳性对照，用0.01 mmol/L 人参皂苷Rg1孵育C2C12细胞48 h，流式细胞术检测C2C12细胞的增殖率，结果见图3.与空白组比较可见，人参皂苷Rg1处理组C2C12细胞的增殖率明显升高，并且已接近IGF-1组，表明人参皂苷Rg1能够显著提高C2C12细胞的增殖率.

2.3 细胞分化

用人参皂苷Rg1孵育C2C12细胞，并用2%马血清诱导细胞分化，培养5 d后利用10×20倍显微镜进行观察、拍照，结果见图4.与空白组比较可见，人参皂苷Rg1处理组细胞明显变长，细胞纤维化程度增强，细胞排列更加整齐，生长更具有方向性.对细胞长度进行测量后发现，人参皂苷Rg1对C2C12细胞长度的增加呈浓度依赖性，表明人参皂苷Rg1能够促进C2C12细胞的分化.

图3 人参皂苷Rg1对C2C12细胞增殖率的影响

图4 人参皂苷Rg1对C2C12细胞分化的影响

2.4 肌球蛋白重链(MyHC)表达

为进一步验证人参皂苷Rg1促进C2C12细胞分化的功能，将C2C12细胞用2%马血清诱导，人参皂苷Rg1分别孵育3，5，7 d后，利用蛋白质免疫印迹法检测MyHC的表达情况，结果见图5.由图5可见，人参皂苷Rg1能够呈浓度依赖性地提高C2C12细胞MyHC的表达量，0.01 mmol/L处理组效果最好.这种促进效应可以持续7 d以上，第7天MyHC相对表达量最高，说明在一定时间内，随着人参皂苷Rg1孵育天数的增多，对细胞MyHC表达的促进作用也逐渐增强.表明人参皂苷Rg1能够呈浓度依赖性、时间依赖性地促进C2C12细胞终末分化标志蛋白MyHC的表达，证明了人参皂苷Rg1对C2C12细胞的促分化作用.

图5 人参皂苷Rg1对C2C12细胞肌球蛋白重链MyHC表达的影响

2.5 肌细胞生成素(MyoG)表达

骨骼肌成肌细胞分化受多种成肌分化因子调节[11]，其中MyoG在骨骼肌分化的后期起着关键性的作用，常用于骨骼肌分化标志物的检测[12-13].人参皂苷Rg1分别孵育C2C12细胞3，5，7 d后，利用蛋白质印迹法检测MyoG的表达水平，结果见图6.由图6可见，人参皂苷Rg1处理后MyoG表达水平都有不同程度的升高，且具有浓度依赖性.其中0.01 mmol/L处理组在不同时间梯度中MyoG相对表达量最好，分别是空白组的1.83，2.14和2.2倍.由此可见，人参皂苷Rg1能够上调MyoG表达，再次证明Rg1对C2C12具有促进分化的作用.

图6 人参皂苷Rg1对C2C12细胞中肌细胞生成素MyoG蛋白表达的影响

3 结论

骨骼肌是人体动力产生器官，不论是废用性萎缩、衰老，还是病理性肌萎缩，都会对患者的生活质量造成极大的影响.目前，许多学者致力于研究安全有效的治疗骨骼肌损伤的方法，其中，天然、无副作用的生物药物越来越受到学者的关注.人参的抗肿瘤、抗氧化和保护心血管的作用已经被人们所认识.人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分之一，在增强学习记忆和神经保护等方面都具有明显的功效.

本文的研究结果表明，人参皂苷Rg1对小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12的增殖与分化均具有良好的促进作用.细胞计数结果显示，人参皂苷Rg1孵育的C2C12细胞数目明显增多.细胞活力检测表明，C2C12细胞活性与人参皂苷Rg1呈浓度依赖性增加，人参皂苷Rg1对提高C2C12细胞活力有促进作用.人参皂苷Rg1对C2C12细胞增殖率的影响也很显著，接近于胰岛素样生长因子-1.

成人骨骼肌损伤修复是一个高度同步化的过程，成肌细胞经过增殖、分化和融合形成新的肌纤维并重构收缩功能.其中，成肌细胞分化为可收缩的肌纤维是一个非常重要环节.成肌细胞分化受多种生肌调节因子调控，而肌细胞生成素(MyoG)是一个重要的促分化因子，在肌分化的早期参与正常肌管的形成.C2C12细胞经人参皂苷Rg1孵育后，MyoG的表达明显上调，对启动成肌细胞分化具有重要作用.肌球蛋白重链(MyHC)是成肌细胞分化末期的标志性蛋白，人参皂苷Rg1能够呈浓度依赖性地增加MyHC的表达水平，促进了骨骼肌成肌细胞C2C12的分化.这些结果表明，利用人参皂苷Rg1孵育C2C12细胞，既能促进细胞增殖、提高细胞活力，还能促进细胞分化.本研究为骨骼肌受损后治疗与修复提供了一个新的靶点，也为如何提高运动人员的骨骼肌机能提供了新的思路和方法.