猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的ITIM基序对IFN-β产生的正调节作用

魏凤灵，张莹莹，许瑞勤，李 闻，李想通，孙杨杨，张留君，杨国宇，夏平安，张改平

(河南农业大学 牧医工程学院，郑州 450002)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的高度接触性传染病。其特征为母猪的流产，产死胎和木乃伊胎；幼龄仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡[1]。该病是威胁全球养猪业的最重要传染病之一，给我国养猪业造成巨大经济损失。PRRSV是正链单股RNA病毒，其基因组全长约 15 kb，含 10 个开放阅读框，其中ORF1a 和ORF1b 主要编码与病毒复制和转录相关的16 种非结构蛋白[2-3]，其中ORF2～5至少编码 7种囊膜糖蛋白，包括主要结构蛋白GP5蛋白和次要结构蛋白GP4、GP3、GP2a 蛋白以及小分子疏水蛋白 E(GP2b)和ORF5a 蛋白。ORF6编码M蛋白，ORF7编码N蛋白(核衣壳蛋白)[4]。

PRRSV是一种猪免疫抑制病病毒，早期感染可诱导Ⅰ型干扰素的产生，感染后期Ⅰ型干扰素的产生则受到明显抑制[5-8]。PRRSV诱导Ⅰ型干扰素产生是一个动态平衡过程，受病毒自身成分和宿主细胞自身成分的双重调节。目前有关PRRSV的非结构蛋白负调控Ⅰ型干扰素产生的机制研究得比较清楚，而其结构蛋白调节Ⅰ型干扰素产生的相关机制研究得相对较少。免疫细胞表面存在着调控天然免疫的酪氨酸受体分子，包括含ITAM激活型基序的激活型受体和含ITIM抑制型基序的抑制型受体。激活型ITAM基序介导抗病毒炎症因子分泌的信号具有双重性[9-11]，而抑制型ITIM基序主要是反向激活Ⅰ型干扰素的产生。序列分析显示PRRSV GP3、GP5和M等结构蛋白中都存在一段ITIM抑制基序，但该基序在PRRSV诱导Ⅰ型干扰素的产生过程中是否具有调节作用还不清楚。

SHP-1和SHP-2都属于非受体样的蛋白酪氨酸磷酸酶，是胞内负调控分子，在细胞磷酸化调控的信号传导途径中发挥重要作用。SHP-1可抑制TLR信号介导的NF-κB和MAPK的激活，从而抑制炎性细胞因子的产生，但有研究表明SHP-1可通过相反的方式调节Ⅰ型干扰素的产生，对TLR和RIG-I介导的Ⅰ型干扰素的产生有激活作用[12]。研究表明SHP-2可抑制TLR3-TRIF依赖型信号通路，负调控JAK激酶以及IFN-α和IFN-γ启动的STAT转录信号通路的信号转导和激活因子[13-14]。

本试验将通过检测TLR介导信号通路中TRIF、MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7、NF-κB(p65)、IFN-β等关键分子及SHP-1、SHP-2的mRNA转录水平变化及其相互关系，来研究PRRSV M蛋白中ITIM抑制基序在PRRSV诱导Ⅰ型干扰素产生中作用，为进一步明确PRRSV感染诱导Ⅰ型干扰素产生的平衡作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 载体、菌种、病毒、细胞株

载体pcDNA3.0、DH5α菌株、PRRSV Hn-1/06毒株(TCID50为104.8·mL-1)及Marc-145细胞均由本实验室保存。

1.2 主要试剂

Reverse Transcriptase M-MLV、dNTPs、Oligod(T)、Ribonuclease Inhibitor、Trizol、LipofectamineTM2000转染试剂、RIPA裂解液、T4连接酶、限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ等均购自宝生物工程(大连)有限公司，鼠抗PRRSV Hn-1/06毒株IgG(ELISA 1∶6 400)由本实验室保存，兔抗鼠HRP标记的IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 重组质粒的构建

ORF6基因片段长525 bp，其中 ITIM基序对应碱基位点为70—87 bp，并将ORF6基因分成两段，即为片段1(1—69 bp)和片段2(88—525 bp)，简称为D1和D2。设计扩增ORF6、D1、D2片段引物，序列如下,GP6 F: 5′-CCCAAGCTTATGGGG- TCGTCCTTAGATGA-3′，GP6 R：5′-CGGAATTCTTATTTGGCATATTTGACAAGG-3′；D1 F:5′- CCCAAGCTTATGGGGTCGTCCTTAGATGA-3′，D1 R:5′-CATATATCATAGAAAACGCCAAA-AGCACC-3′；D2 F：5′-GGCGTTTTCTATGAT-ATATGCCCTAAAGGTGAG-3′，D2 R：5′-CG-GAATTCTTATTTGGCATATTTGACAAGG-3′(斜体及下划线表示酶切位点)。采用SOE-PCR扩增GP6△ITIM片段。分别将ORF6和GP6△ITIM基因片段连接至载体pcDNA3.0中，测序正确后用于后续试验。

1.4 Western blot检测

将Marc-145 细胞接种于12孔板，待细胞长至约80%时进行重组质粒转染。收集48 h转染后细胞，加入适量的RIPA裂解液，离心取上清，用Western blot方法检测目的蛋白的表达。

1.5 细胞因子mRNA转录水平检测

将Marc-145 细胞接种于12孔板，待细胞长至约80%时进行重组质粒转染，具体操作参照LipofectamineTM2000试剂说明书。

分别收集转染后培养12、24、36及48 h的细胞，根据实验室建立的荧光定量PCR方法检测转染细胞中不同时间段TRIF、MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7、NF-κB及IFN-β的mRNA转录水平。荧光定量PCR反应程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，TRIF、NF-κB：64 ℃ 34 s，MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7：62 ℃ 34 s，IFN-β：61 ℃ 34 s，共40个循环。

1.6 靶标SHP-1、SHP-2的siRNA干扰效率检测

根据SHP-1、SHP-2基因序列，分别设计SHP-1-siRNA-781、SHP-1-siRNA-832、SHP-1-siRNA-2000、SHP-2-siRNA-420、SHP-2-siRNA-639、SHP-2-siRNA-1335 6条RNAi靶序列，同时设计一条阴性对照siRNA，如表1所示。将上述siRNA转染Marc-145细胞，设置正常Marc-145细胞作为空白对照，分别培养12、24、36、48 h。收集细胞，荧光定量PCR方法检测SHP-1、SHP-2基因的干扰效率。

表1SHP-1、SHP-2基因siRNA片段

Table1siRNAsegmentsofSHP-1andSHP-2

基因Gene靶点NumbersiRNA片段(5′→3′)siRNA segmentsSHP-1781GCAAGAACCAGGGUGACUUTTAAGUCACCCUGGUUCUUGCTT832CCCAUAUUCGGAUCCAGAATTUUCUGGAUCCGAAUAUGGGTT 2 000GCAGGAAAGUCUGUUUCAUTTAUGAGGCAGACUUUCCUGCTTSHP-2420CCAGUAUUACAUGGAACAUTTAUGUUCCAUGUAAUACUGGTT639GCGCACUGGUGAUGACAAATTUUUGUCAUCACCAGUGCGCTT1 335GCGUGUUAGGAAUGUCAAATTUUUGACAUUCCUAACACGCTTNegative controlUUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.7 SHP-1与SHP-2的沉默试验

将SHP-1-siRNA、SHP-2-siRNA干扰效率最高的序列分别与重组质粒pcDNA3.0-GP6、 pcDNA3.0-GP6△ITIM共转染Marc-145 细胞，荧光定量PCR方法检测转染细胞中TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-β的mRNA转录水平。

2 结 果

2.1 重组质粒pcDNA3.0-GP6与pcDNA3.0-GP6△ITIM的鉴定

将构建的重组质粒pcDNA3.0-GP6与pcDNA3.0-GP6△ITIM测序并分析比对，结果与其目的片段相似性高达100%，证明重组质粒构建正确。

2.2 目的蛋白的检测

收集重组质粒pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM及空载体pcDNA3.0转染48 h后的Marc-145 细胞，用鼠抗PRRSV Hn-1/06 IgG和兔抗鼠HRP-IgG进行Western blot检测。pcDNA3.0-GP6与pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组出现了大小在19 ku左右的条带，而空载体pcDNA3.0转染组与Marc-145 细胞空白组无此条带(图1)。

M. 蛋白质相对分子质量标准；1. Marc-145细胞空白对照组；2. pcDNA3.0-GP6转染组；3. pcDNA3.0空载体转染组；4. pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组M. Protein marker；1. Normal Marc-145 cells group；2. Transfection of pcDNA3.0-GP6；3. Transfection of pcDNA3.0；4. Transfection of pcDNA3.0-GP6△ITIM图1 目的蛋白Western blot检测结果Fig.1 Western blot analysis of target proteins

2.3 转染细胞相关因子mRNA的转录水平

将pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM分别转染Marc-145 细胞，设Marc-145 细胞为对照组，培养12、24、36及48 h后用荧光定量PCR方法检测相应细胞中MyD88、TRAF6、TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7、IFN-β的mRNA转录水平，如图2所示，转染pcDNA3.0-GP6后与对照组相比，MyD88、TRAF6、NF-κB、IRF3、IRF7 mRNA转录水平在12、24、36 及48 h四个时间段均升高，且极显著高于对照组(P<0.01或P<0.001)，而TRIFmRNA转录水平在24及36 h时间段均极显著高于对照组(P<0.001)，IFN-β mRNA转录水平在24、36及48 h三个时间段均极显著高于对照组(P<0.001)，说明GP6蛋白的表达可增强IFN-β及其信号通路中关键分子的表达水平。pcDNA3.0-GP6转染组与pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组相比，IFN-β mRNA转录水平在24、36及48 h三个时间段均显著上升(P<0.05或P<0.001)，TRIFmRNA转录水平在24及36 h极显著上升(P<0.001)，IRF3 mRNA转录水平在12、24、36及48 h四个时间段均极显著上升(P<0.01或P<0.001)；IRF7 mRNA转录水平在24、36及48 h三个时间段均极显著上升(P<0.001)；NF-κB mRNA转录水平在12 h极显著低于pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组(P<0.001)，24 h后开始上升，36及48 h则极显著高于pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组(P<0.001)；而MyD88 mRNA转录水平则在12、24及36 h极显著下降(P<0.001)，TRAF6 mRNA转录水平在12、24及36 h显著下降(P<0.05或P<0.001)。这说明IFN-β mRNA转录水平升高可能与TLR介导的信号通路中TRIF、IRF3、IRF7 mRNA转录水平升高相关，与MyD88、TRAF6分子不相关，而NF-κB则在36 h后作用显著。

A. MyD88；B. TRIF；C. TRAF6；D. NF-κB； E. IRF3；F. IRF7；G. IFN-β；***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05图2 正常细胞转染pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM质粒后关键细胞因子mRNA转录水平变化Fig.2 The cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0, pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

2.4 Poly(I:C)刺激转染细胞相关因子mRNA转录水平

用浓度为500 ng·mL-1Poly(I:C) 分别刺激正常Marc-145 细胞、转染pcDNA3.0-GP6的Marc-145 细胞和转染pcDNA3.0-GP6△ITIM的Marc-145 细胞，培养12、24、36及48 h后用荧光定量PCR方法检测相应细胞中TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7及IFN-β mRNA转录水平。如图3所示，Poly(I:C) 刺激组的IFN-β mRNA转录水平及其信号通路中的TRIF、NF-κB、IRF3、IRF7及IFN-β关键分子的mRNA转录水平在12～48 h均高于Marc-145 细胞对照组，其中TRIFmRNA转录水平在12～36 h差异极显著(P<0.01或P<0.001)，IRF3及IRF7 mRNA转录水平在12、24 h差异极显著(P<0.01或P<0.001)，NF-κB mRNA转录水平在24、36 h差异极显著(P<0.001)，IFN-β mRNA转录水平在 24～48 h差异极显著(P<0.001)，说明Poly(I:C) 可增强IFN-β及关键分子mRNA转录水平； pcDNA3.0-GP6转染组的IFN-β mRNA转录水平在36及48 h高于pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组(缺失转染组)，且36 h差异极显著(P<0.01)，其信号通路中的TRIFmRNA转录水平在12、24、36及48 h四个时间段都高于缺失转染组，其中24与36 h差异显著(P<0.001或P<0.05)；IRF3 mRNA转录水平在12、24及36 h显著高于缺失转染组(P<0.05或P<0.01)；IRF7 mRNA转录水平在36及48 h显著高于缺失转染组(P<0.05或P<0.01)；NF-κB mRNA转录水平在36 h极显著高于缺失转染组(P<0.001)。这些结果显示M蛋白的ITIM基序可上调由Poly(I:C) 刺激产生的IFN-β mRNA转录水平，而TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等关键分子在该信号通路中发挥作用。

A. TRIF；B. NF-κB；C. IRF3；D. IRF7； E. IFN-β； ***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05图3 Poly(I:C)刺激后正常细胞转染pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM质粒后关键细胞因子mRNA转录水平变化Fig.3 Effect of Poly(I:C) on the cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

2.5 靶标SHP-1、SHP-2的siRNA干扰效率检测

SHP-1、SHP-2的siRNA干扰效率检测结果如图4所示，空白对照组与阴性对照组的mRNA转录水平基本一致，6条干扰序列在12～48 h时间段均能降低靶基因SHP-1、SHP-2 mRNA转录水平，其中SHP-1-siRNA-781在12、36及48 h显著下调SHP-1 mRNA转录水平(P<0.001或P<0.05)，SHP-2-siRNA-1335在24、36及48 h极显著下调SHP-2 mRNA转录水平(P<0.001)，结果表明，SHP-1-siRNA-781与SHP-2-siRNA-1335的干扰效果最优。

A. SHP-1；B. SHP-2； ***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05图4 siRNA对SHP-1、SHP-2的干扰情况Fig.4 The effects of siRNA on SHP-1 or SHP-2 gene of Macr-145 cells

2.6 沉默SHP-1和SHP-2后相关因子mRNA的转录水平

将SHP-1-siRNA-781、SHP-2-siRNA-1335分别与pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM重组质粒转染Marc-145 细胞，培养 12、24、36及48 h后用荧光定量PCR方法检测相应细胞中TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB及IFN-β mRNA转录水平。如图5所示，pcDNA3.0-GP6转染组TRIF、IRF3、IRF7及NF-κB mRNA转录水平分别在24～36 h、24～48 h、12～48 h、12 h不同时间段内均显著低于pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组(P<0.05、P<0.01或P<0.001)；pcDNA3.0-GP6转染组IFN-β mRNA转录水平在12～48 h均低于pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组(缺失转染组)，36及48 h时期差异极显著(P<0.001)。结果显示，沉默SHP-1后，M蛋白的ITIM基序能够显著下调细胞中TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB、IFN-β mRNA转录水平，表明SHP-1分子可能是ITIM基序激活调控TLR3-TRIF-IFN-β信号通路中的关键分子。如图6所示，沉默SHP-2后，pcDNA3.0-GP6转染组TRIFmRNA转录水平12及48 h高于缺失转染组但差异不显著，24及36 h极显著低于缺失转染组(P<0.01或P<0.001)；pcDNA3.0-GP6转染组IRF3 mRNA转录水平在12及48 h显著高于缺失转染组(P<0.05或P<0.001)，24及36 h低于缺失转染组但差异不显著；pcDNA3.0-GP6转染组IRF7 mRNA转录水平在12、24、36及48 h高于缺失转染组，12及36 h差异极显著(P<0.01)；pcDNA3.0-GP6转染组NF-κB mRNA转录水平在12及48 h高于缺失转染组，12 h差异极显著(P<0.001)，24及36 h均低于缺失转染组，24 h差异极显著(P<0.01)；pcDNA3.0-GP6转染组IFN-β mRNA转录水平在12、36及48 h均高于缺失转染组，且12及36 h差异显著(P<0.05或P<0.001)，而24 h低于缺失转染组且差异极显著(P<0.001)；结果表明，瞬时干扰SHP-2后， ITIM基序对TRIF、IRF3、NF-κB及IFN-β mRNA转录水平的调节均为先升高，再降低，后趋于稳定，对IRF7则能够持续上调到48 h。综上所述， SHP-1分子可能是ITIM基序激活调控TLR3-TRIF-IFN-β信号通路中的关键分子，而ITIM 基序与SHP-2在该通路中的调节关系还需要进一步探索。

3 讨 论

本研究中，将构建的重组质粒pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM转染细胞后发现，pcDNA3.0-GP6转染组TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-β mRNA转录水平均高于pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组，而MyD88、TRAF6转录水平低于pcDNA3.0-GP6△ITIM转染组。这一结果说明M蛋白ITIM基序的缺失影响了IFN-β的产生，而TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等关键分子在IFN-β的产生中发挥作用，MyD88 和TRAF6关键分子可能作用不明显。由于PRRSV复制过程中产生的双股RNA可被宿主细胞位于吞噬体膜上的TLR3受体识别，激活TLR3信号通路，招募TRIF，随后TRIF与TBK、IKKi相互作用，TBK和IKKi作用于IRF3使其磷酸化，磷酸化后的IRF3转入细胞核激活Ⅰ型干扰素启动子，诱导IFN-β的产生[15]，而病毒蛋白等自身成分可对TLR3-TRIF信号通路进行调节[16]，本试验结果初步证明含有ITIM基序的病毒蛋白可正调节TLR3-TRIF信号通路，增强IFN-β的产生。

A.TRIF；B. IRF3；C. IRF7；D. NF-κB；E. IFN-β；***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05图5 SHP-1-siRNA对正常细胞转染pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM质粒后关键细胞因子mRNA转录水平变化的影响Fig.5 Effect of SHP-1-siRNA on the cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0, pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

A.TRIF；B. IRF3；C. IRF7；D. NF-κB；E. IFN-β；***. P<0.001；**. P<0.01；*. P<0.05图6 SHP-2-siRNA对正常细胞转染pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6和pcDNA3.0-GP6△ITIM质粒后关键细胞因子转录水平的影响Fig.6 Effect of SHP-2-siRNA on the cytokines mRNA levels in normal cells or transfection of pcDNA3.0、pcDNA3.0-GP6 and pcDNA3.0-GP6△ITIM were measured by real-time quantitative RT-PCR

本研究通过Poly(I:C) 刺激试验证明M蛋白的ITIM基序能进一步上调Poly(I:C) 激活通路中的TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等关键因子以及IFN-β的mRNA转录水平。这一结果进一步证明了M蛋白的ITIM基序可经TLR3-TRIF信号通路对IFN-β的产生进行调节。

笔者以前的研究发现含有ITIM基序的抑制型受体FcγR IIb被选择性激活后通过增加Ⅰ型干扰素水平来抑制PRRSV的复制[17]。有资料表明Ly49Q 受体分子在胞浆样树突状细胞(pDC)膜上高度表达，其细胞质结构域中含有的ITIM基序能使Ly49Q 受体分子正向调节Ⅰ型干扰素产生[18]；Trem系列蛋白分子在胞浆样树突状细胞(pDC) 膜上也高度表达，其中Trem6的细胞质结构域中含有ITIM基序是TLR介导的Ⅰ型干扰素产生所必需的[19]。这些研究结果表明抑制型ITIM基序主要是反向激活Ⅰ型干扰素的产生，与笔者的研究结果一致，但相关机制还需要进一步研究。

研究表明灭活的IRAK1能够增加由TRIF和RIG-I诱导激活的IRF3/IRF7磷酸化，促进Ⅰ型干扰素的表达[20]，也有文献报道，SHP-1能够直接结合并抑制激酶IRAK1的活化来促进TLR和RIG-I激活的Ⅰ型干扰素的产生[13]，这是由于IRAK1激酶的结构域中包含ITIM基序，SHP-1结合IRAK1激酶结构域中的ITIM基序后可能通过竞争或空间位阻机制抑制IRAK1激酶活性以及IRAK1自身磷酸化，从而解除了IRAK1对I型干扰素产生的抑制作用，这些研究结果说明，SHP-1可通过与含ITIM基序的IRAK1分子结合激活Ⅰ型干扰素的产生。本研究证明沉默SHP-1后，M 蛋白的ITIM基序可显著下调细胞中TRIF、IRF3、IRF7、IFN-β mRNA转录水平，这说明SHP-1在PRRSV M蛋白的ITIM基序介导IFN-β产生的信号通路中具有激活调节作用，然而其相关机制还不清楚，需要进一步研究。研究表明，SHP-2仅特异性抑制TRIF依赖性促炎性细胞因子的产生，与SHP-1可发挥协同作用，但更多时候，SHP-1和SHP-2对信号传导具有相反的调节作用[15, 21]。本研究证明沉默SHP-2后，ITIM基序对TRIF、IRF3、NF-κB、IFN-β的调节规律均为先升高，再降低，后趋于稳定，这说明SHP-2在PRRSV M蛋白的ITIM基序介导IFN-β产生的信号通路中作用不明显。

4 结 论

含有ITIM基序的PRRSV M蛋白可正调节TLR3-TRIF信号通路，增强IFN-β的产生。ITIM基序能上调Poly(I:C) 激活通路中的TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB等关键因子以及IFN-β的mRNA转录水平。SHP-1在PRRSV M蛋白的ITIM基序介导IFN-β产生的信号通路中具有激活调节作用，SHP-2在PRRSV M蛋白的ITIM基序介导IFN-β产生的信号通路中作用不明显。