高低剩余采食量北京鸭品系皮脂蛋白质组差异研究

张云生，杨宇泽，郭占宝，谢 明，常 卓，张智英，侯水生*

(1．中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193； 2．西北农林科技大学 动物科技学院，杨凌 712100；3．北京市畜牧总站，北京 100101)

北京鸭具有生长速度快和育肥快的特点，因此北京烤鸭也是驰名中外的佳肴。但是随着人们对健康食品需求的增加，低皮脂率的北京鸭越来越受到大众的欢迎，因此选择胴体脂肪含量适宜的北京鸭品种就非常必要。鸭皮脂率的高低与鸭胸肉中的脂肪含量呈正相关，鸭肉中过低的脂肪含量会影响鸭肉的风味和口感，而较高的脂肪含量会改善肉的风味和品质，因此需要对北京鸭的脂肪含量进行不同方向的选择，以满足人们对不同风味鸭肉的需求。鸭肉脂肪含量的高低取决于日粮组成、血浆激素水平等因素[1-4]。瘦肉型和肉脂型品种间的差异主要由代谢过程驱动[5-6]。瘦肉型和肉脂型鸭保存能量的方式也有很大的差异，瘦肉型主要通过增加蛋白质的沉积保存能量，而肉脂型则优先使用饲料能量来进行脂肪组织的合成[7]。

Koch等[8]首次提出以剩余采食量(residual feed intake, RFI)作为评价动物个体饲料转化效率的指标。研究表明，与高RFI猪相比，低RFI猪的胴体水分和脂肪含量较低，但是蛋白含量略高[9-10]；猪腰部更大、背膘更薄，瘦肉率更高[11-15]。Begli等[16]研究表明，RFI性状的育种值与鸡F2群体的体重腹脂率等显著相关，与胸肌率呈负相关。Zhang等[17]研究表明，RFI与北京鸭的皮脂率呈显著正相关。因此，本研究对北京鸭的RFI性状进行了连续3个世代的选择，形成了两个胴体脂肪含量差异显著的北京鸭品系。为了更清楚的了解不同RFI品系北京鸭脂肪沉积能力差异的原因，本试验采用了iTRAQ蛋白质定量技术和生物信息学技术分析了不同RFI品系的北京鸭皮脂蛋白质组分，为进一步研究北京鸭脂肪的沉积机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用不同品系北京鸭由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所种鸭场提供。高、低RFI品系各100只雄性雏鸭，同条件下饲养6周，然后各品系随机选取12只取皮脂，液氮保存备用。

主要试剂：iTRAQ®Reagent-8Plex Multiplex Kit(Applied Biosystem)；strata-X C18 除盐柱(phenomenex)；SCX强阳离子交换柱(phenomenex Luna SCX 100A)；R6834RNA试剂盒(Omega美国)；Thermo First cDNA合成试剂盒(SinoGene中国)

1.2 方法

1.2.1 不同RFI品系北京鸭皮脂蛋白提取消化 将皮脂样品在液氮中磨成粉，然后加入4倍体积的预冷丙酮沉淀2 h，20 000 g离心30 min，收集沉淀，重复2次上述操作；然后加入TEAB溶解蛋白。采用Bradford方法定量总蛋白。高RFI组和低RFI组分别等量混合12只个体的皮脂蛋白。

1.2.2 不同RFI品系北京鸭皮脂蛋白iTRAQ标记及肽段分离 提取的总蛋白进行酶切除盐。根据iTRAQ试剂操作手册步骤进行操作。两份样品分别用113和114 iTRAQ试剂标记。

1.2.3 不同RFI品系北京鸭皮脂部分差异蛋白编码基因的实时定量PCR分析 使用总RNA提取试剂盒从皮脂中制备总RNA，然后根据生产商提供的使用说明书利用Thermo First cDNA合成试剂盒(SinoGene，中国)进行cDNA合成。使用实时PCR检测系统(Applied Biosystems StepOnePLUS)进行实时定量PCR。

选取部分差异蛋白的编码基因，分析其mRNA在鸭高、低RFI品系皮脂中的表达量。应用Primer premier5.0软件设计差异表达基因实时定量PCR引物序列(表1)。用β-actin基因对样品进行标准化，然后使用2-ΔΔCt方法计算倍数变化，应用SPSS软件进行组间差异显著性检验。

表1差异表达基因实时定量PCR引物序列

Table1Theprimersequenceforreal-timePCRofthedifferentiallyexpressedgenes

简写Abbreviation基因名称Gene nameNCBI登录号NCBI accession No.引物序列(5′→3′)Primer sequence产物长度/bpProduct sizeFASNfatty acidgi| 630056824F:GTGCCAGCAAAGCTTTCGATGC142synthaseR:GGAGTAACACTGATGGCTTTAAFABP1basic fatty acidgi| 878278835F:AGTGGAACCTGGCAGGTCTAT111binding proteinR:GATATTAAGCCTGTTGTTGAAPLINperilipingi| 878278714F:AAGCCGAGCGCACCCCAGGCAC120R:GCAGGAGAAAGCAGGGAAGAAG

1.3 质谱检测与数据处理

将样品应用LC-MS-MS进行检测，然后用ProteinPilot软件分析质谱数据，并对蛋白质组iTRAQ定量，差异倍数达到1.5倍视为显著差异表达蛋白。运用GO富集分析对差异表达蛋白进行分析，选择GO(Gene Ontology)的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白进行分类。利用SING在线软件对差异蛋白进行网络互作分析。

2 结 果

2.1 高、低RFI品系北京鸭皮脂差异表达蛋白及GO分析

在北京鸭皮脂中鉴定到了859个蛋白，选择表达量差异1.5倍以上的作为显著差异标准，共发现59个差异表达蛋白，其中在低RFI品系中高表达的蛋白34个，在高RFI品系中高表达蛋白25个(表2)。

对皮脂中差异表达蛋白进行GO分析，结果表明，在细胞组分本体中，差异表达蛋白主要分布于中间丝状体、细胞骨架、包围区域、细胞连接以及线粒体(图1 A)；在生物学过程本体中，差异蛋白主要包括组织发育、有机酸代谢、脂类应答、脂类合成、角质化、上皮细胞分化等生物学过程(图1B)；在分子功能本体中，差异表达蛋白主要参与离子结合、氧化还原、细胞骨架构成、裂解酶活性等生物学功能(图1 C)。

2.2 高、低RFI品系北京鸭皮脂差异表达蛋白网络互作分析

大部分的单个蛋白质只是作为活性细胞中较大蛋白质复合物的基本组成部分，蛋白质之间需要相互协作才能发挥出相应的生物学功能。因此，这些差异丰度蛋白很可能就是蛋白质-蛋白质相互作用中具有各种关系的关键节点蛋白，本研究应用STRING 10.5在线工具分析了差异表达蛋白之间的相互作用，不同RFI品系鸭皮脂差异表达蛋白之间的互作分析见图2。差异表达蛋白主要参与脂肪代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、粘连锚定以及离子、维生素结合等功能。

2.3 高、低RFI品系北京鸭部分皮脂差异表达蛋白编码基因qRT-PCR分析

利用qRT-PCR方法测定6周龄高低RFI北京鸭品系皮脂中脂肪酸合酶(FASN)、脂肪酸结合蛋白(FABP1)、围脂滴蛋白(PLIN)mRNA表达水平(图3)。由图3可以看出，高RFI品系北京鸭的脂肪酸合酶、脂肪酸结合蛋白和围脂滴蛋白对应基因的mRNA表达水平均显著高于低RFI品系(P<0.05)。表2结果显示,上述3个的蛋白在高RFI品系北京鸭中的表达量均高于低RFI品系。表明不同RFI品系北京鸭脂肪酸合酶、脂肪酸结合蛋白以及围脂滴蛋白编码基因的mRNA表达水平与蛋白质表达水平一致。

3 讨 论

脂肪酸合成和沉积是一个复杂的生物学过程，在这个过程中需要多种蛋白质参与。研究表明，脂肪酸合酶是一种催化脂肪酸合成的多酶蛋白，其主要功能是在NADPH存在下催化合成长链饱和脂肪酸、乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A[18]，这种机制是将丙二酰辅酶A中的两个碳单元依次加入生长脂肪酸链；乙酰辅酶A酰基转移酶在许多重要的生化途径中具有关键的作用[19]，其中就包括β-羟基丁酸、类固醇等各种生物合成途径。乙酰辅酶A酰基转移酶超家族酶可以通过硫脂依赖性克莱森凝聚反应机理催化碳-碳键的形成，而碳-碳键的形成是生成脂肪酸和聚酮化合物生物合成途径中的关键步骤。这些蛋白均在高RFI品系北京鸭的皮脂中高表达，表明高RFI品系北京鸭的脂肪合成能力要强于低RFI品系北京鸭。

表2低RFI与高RFI北京鸭皮脂之间差异表达蛋白

Table2ThedifferentiallyexpressedproteinsidentifiedinthesebumofthelowRFIandhighRFIPekinducks

名称Name登记号Accession得分Score覆盖率/%Coverage肽段Peptide差异倍数Fold change髓磷脂蛋白P0 Myelin protein P0R7VRG8230.1217.3810.15胶原蛋白α-1(II)链Collagen alpha-1(II) chain H9L2B7110.742.6830.17脂肪酸合酶Fatty acid synthaseR0KBE21 515.4625.95460.26谷胱甘肽过氧化物酶Glutathione peroxidaseU3I3K155.1222.7530.27核糖核酸酶UK14 Ribonuclease UK14R0JFK776.8210.0940.30磷酸丝氨酸氨基转移酶Phosphoserine aminotransferaseH0YYW725.782.4310.31磷酸烯醇丙酮酸羧激酶Phosphoenolpyruvate carboxykinaseR0J72323.916.9910.32二磷酸核苷激酶Nucleoside diphosphate kinaseO57536133.8033.3360.33谷氨酰胺合成酶Glutamine synthetase U3ISF5210.3021.6270.36载脂蛋白-CA Apolipoprotein CAQ9PRR577.851.0230.36碱性脂肪酸结合蛋白Basic fatty acid binding proteinD7REA1240.3051.5960.37视黄醛脱氢酶Retinal dehydrogenase 1F1NJC720.014.2710.38α1整合素Alpha1 integrinO4209438.364.2320.41微管蛋白α-5链Tubulin alpha-5 chain P0964477.9516.8620.42核心蛋白多糖Decorin R0LLK8498.4843.70120.44乙醇脱氢酶1 Alcohol dehydrogenase 1U3I4I842.966.0810.44苹果酸脱氢酶Malate dehydrogenaseG1N071427.4353.31120.47丙酮酸羧化酶Pyruvate carboxylaseQ8JHF687.645.9520.51丙酮酸脱氢酶复合体乙酰转移酶组分U3ICQ7122.0410.2750.52Acetyltransferase component of pyruvatedehydrogenase complex胶原蛋白α-1(I)链Collagen alpha-1(I) chainP024571 222.4431.18260.524-氨基-咪唑甲酰胺核糖核酸转化酶IMP环化水解酶Q5XKY5247.5910.7610.53Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase/IMP cyclohydrolaseC-1-四氢叶酸合成酶C-1-tetrahydrofolate synthaseR0JPE3437.9221.49140.55二氢叶酸还原酶Dihydrofolate reductaseA3RKL398.9914.7940.55二氢硫辛酰脱氢酶Dihydrolipoyl dehydrogenaseU3IR48159.6712.4850.56围脂滴蛋白PerilipinF6KFT31036.0570.70250.56NAD依赖性脱乙酰酶SIRT2Q68BG125.073.5610.59NAD-dependent deacetylase SIRT2ATP合成酶亚基αATP synthase subunit alphaF1NI22534.9825.13110.62表皮分化特异性蛋白质R0K1T639.109.3310.63Epidermal differentiation-specific protein

(转下页 Carried forward)

A.细胞组分；B.生物学过程；C.分子功能A.Cellular component; B.Biological process; C. Molecular function图1 皮脂差异蛋白质GO分析Fig.1 Gene ontology (GO) analysis of differential proteins in sebum

红色表示基因融合迹象，绿色表示相邻迹象，蓝色表示共同迹象，紫色表示试验迹象，黄色表示文本挖掘迹象，浅蓝色表示数据库迹象，黑色表示共表达迹象，浅紫色表示蛋白质同源性Red indicates gene fusions evidence, green indicates neighborhood evidence, blue indicates co-occurrence evidence, purple indicates experimental evidence, yellow indicates text-mining evidence, light blue indicates database evidence, black indicates co-expression evidence, light purple indicates protein homology图2 不同RFI鸭群体皮脂差异表达蛋白生物学互作网络Fig.2 Biological interaction network of the differentially expressed proteins in sebum of the low RFI and high RFI Pekin ducks

同一组数据不同字母表示差异显著The different letters indicate the significant difference between low and high RFI lines图3 北京鸭不同RFI品系FASN、FABP1、PLIN基因mRNA实时定量PCR分析Fig.3 Validation of FASN, FABP1, PLIN at the mRNA level by quantitative real-time PCR analysis in sebum of different RFI line Pekin ducks

载脂蛋白是一组载脂蛋白家族，载脂蛋白C家族是乳糜微粒，为极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的表面组分，在吸收膳食脂肪期间，载脂蛋白优先分布到富含三酰甘油的乳糜微粒和VLDL[20]。基础脂肪酸结合蛋白是脂肪酸和其他亲脂性物质如类花生酸和类视黄醇的转运蛋白家族[12,21-23]，这些蛋白质被认为可以促进脂肪酸在细胞外和细胞膜之间的转移[24]，该家族成员的过氧化物酶增殖受体(PPAR)被认为可以将亲脂性分子从外细胞膜转运到特定的细胞内受体。在人类中，围脂滴蛋白是与脂肪细胞脂滴相关的最丰富的蛋白质[25]。围脂滴蛋白包裹在脂肪细胞中脂滴的周围，对脂肪组织存储脂滴有着重要的作用[26]。围脂滴蛋白可作为人体天然脂肪酶的保护性涂层，如激素敏感性脂肪酶，将三酰甘油分解为甘油和游离脂肪酸，用于代谢过程，而围脂滴蛋白可以减缓对脂肪酸的分解[27]，对脂肪的沉积具有重要的作用。综上所述，与脂肪合成和沉积相关的重要蛋白质，如脂肪酸合酶、载脂蛋白、基础脂肪酸结合蛋白、围脂滴蛋白、乙酰辅酶A乙酰转移酶等蛋白在高RFI北京鸭品系中高表达表明,高RFI品系北京鸭具有比低RFI品系北京鸭更强的脂肪沉积能力。

4 结 论

本研究对高、低RFI北京鸭品系差异蛋白质组学研究发现，差异表达蛋白中参与脂质代谢过程的蛋白数量最多，主要参与有机酸代谢、脂类应答、脂类合成等生物学过程；其中脂肪酸合酶、围脂滴蛋白、载脂蛋白以及脂肪酸结合蛋白在高RFI品系北京鸭皮脂中高表达，是高RFI品系北京鸭脂肪沉积能力较强的重要原因。