黑糯米酒及黑糯米保健酒品质分析

苏 伟，母 雨，齐 琦，母应春，禹晓婷

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025）

近年来，随着国民经济水平和文化水平的提高，人们对于自身的健康问题越来越重视，健康饮食已然成为热点。据报道，黑糯米中含有人体所需的多种营养物质[1-2]，具有补血、暖胃、补虚、健脾、促进人体微循环等多种生理功能[3]。保健酒是指在酿造过程中加入了中药材或其他的营养成分[4]，对人体具有保健功能，但不以治疗为目的的饮料酒，其必须具备三个属性，即食品属性、功能属性、非药品属性[5]。黑糯米保健酒是以黑糯米为原料，加入药食同源的物质为辅料，经过一系列加工工艺制作而成的营养丰富的饮品。

黑糯米相关产品已有悠久的历史，但关于黑糯米的研究起步较晚。长久以来，黑糯米被添加到各种食品中，但都作为辅料，使得其产品附加值较低。目前对黑糯米的开发利用主要集中在黑糯米酒、黑糯米醋、黑糯米粑及黑糯米酥等具有地方特色的食品。而对于黑糯米酒的研究又集中于营养物质的消化吸收方面，尚未对黑糯米酒的功能成分进行系统分析。

本实验采用AB-INOWAX色谱柱经气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术与超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱联用（ultra high performance liquid chromatography-Q exactive-orbitramass spectrometry，UPLC-QE-MS）测定黑糯米酒与黑糯米保健酒中的风味成分及化学成分，进行对比分析，找到黑糯米保健酒的特有成分，为黑糯米保健酒保健作用研究提供理论与数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑糯米：市售；糖化酶（酶活力10万U/g）：北京索莱宝科学技术有限公司；增香酵母：四川泸州市酿酒科学研究所；Z-20根霉曲：贵州轻工酿酒研究所；芦丁标准品（纯度≥98%）：成都曼思特生物科技有限公司；氯化铝（分析纯）：广东省化学试剂工程技术研究开发中心；氢氧化钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；亚硝酸钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器及设备

HP6890/5957C气相色谱-质谱联用仪、1290 UHPLC超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；Q Exactive Orbitra高分辨质谱：美国ThermoFisherScientific公司；PS-60AL超声仪：深圳市雷德邦电子有限公司；KQ-300DE酶标仪：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

黑糯米酒的制备参照文献[1]进行；黑糯米保健酒的制备参照文献[3]进行。

1.3.2 黑糯米酒与黑糯米保健酒风味成分检测

采用气相色谱-质谱法检测黑糯米酒与黑糯米保健酒风味成分。

样品前处理：用微量注射器量取1 μL样品溶液直接进样。

气相色谱条件：

色谱柱：AB-INOWAX（30 m×0.25 μm×0.25 mm）毛细管柱；柱温：40℃，保留2min；升温程序：5℃/min升至240℃，保持10 min，运行52 min；溶剂延迟时间：1 min；汽化室温度：250℃；载气：高纯氦气（He）；流量：1 mL/min；柱前压：7.64psi；分流比：20∶1。

质谱条件：

离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 529 V；接口温度280℃；质量范围20～500 amu。

定性定量分析：用质谱计算机数据系统对总离子流图中的各个出峰进行检索，核对美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）2005和Wiley 275标准质谱图数据库，确定化学成分。采用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量。

1.3.3 黑糯米酒与黑糯米保健酒化学成分检测

黑糯米酒与黑糯米保健酒化学成分检测采用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱法。

样品前处理：移取100 μL酒液至EP管中，加入300 μL甲醇（含内标），涡旋混匀30 s；超声10 min（冰水浴）后于-20℃静置1h；将酒液在4℃、12000r/min条件下离心15min；取上清液于进样瓶中上机检测。

超高效液相色谱条件：

色谱柱：UPLCHSST3色谱柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；进样体积为1μL，洗脱程序见表1。

表1 超高效液相色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of UPLC

流动相组成：

正离子模式：流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为乙腈。

负离子模式：流动相A为5mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B为乙腈。

质谱条件：

Thermo Q Exactive Orbitrap质谱仪能够在控制软件（Xcalibur，版本：4.0.27）控制下进行一级、二级质谱数据采集。碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：20 eV、40 eV、60 eV，扫描速率：7 Hz。高分辨质谱参数见表2。

表2 质谱参数Table 2 Parameters of mass spectrometry

定性定量分析：使用ProteoWizard软件将质谱原始数据转成mzML格式。再使用XCMS做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作。使用OSI-SMMS（version 1.0，大连达硕信息技术有限公司）软件配合自建数据库进行物质鉴定。采用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 两种黑糯米酒中风味化合物的GC-MS分析结果

采用气相色谱-质谱联用对黑糯米酒和黑糯米保健酒的风味成分进行分析，其总离子流色谱图见图1，各风味成分定性和定量分析结果见表3，两种酒风味成分的种类及数量见图2。

图1 黑糯米酒（A）及黑糯米保健酒（B）风味成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of flavor components in black glutinous rice wine(A)and black glutinous rice health wine(B)analyzed by GC-MS

表3 黑糯米酒与黑糯米保健酒中风味成分GC-MS分析结果Table 3 GC-MS analysis results of flavor components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

续表

由表3可知，在两种酒中共检出53种成分，包含醇类、酮类、酸类、酯类、醛类等，这些成分是构成酒香味成分的骨架和基础，同时也是考察酒质量的主要依据之一[6]。

黑糯米保健酒中共检测到45种香气物质，其主体成分为醇类（39.519%）、酮类（19.467%）、醛类（15.075%）和酸类（9.611%）。主要挥发性物质有乙醇（32.318%）、1,3-二羟基丙酮（11.207%）、5-（羟甲基）糠醛（8.42%）、乙酸（6.518%）、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-4-酮（5.519%）、羟乙醛（4.302%）、甲酸（2.729%）、2-呋喃甲醇（2.569%）。

黑糯米酒中共检测到47种香气成分，其主体风味成分为醇类（57.284%）、醛类（13.161%）和酮类（11.36%）。主要挥发性物质包括乙醇（51.519%）、5-（羟甲基）糠醛（10.982%）、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-4-酮（5.542%）、1,3-二羟基丙酮（5.001%）、乙酸（2.969%）、丙三醇（2.244%）、2-呋喃甲醇（1.911%）。

图2 黑糯米酒与黑糯米保健酒香气成分种类及含量Fig.2 Types and contents of aroma components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

由图2可知，黑糯米保健酒的酸类、醛类、酮类化合物含量高于黑糯米酒，醇类化合物含量低于黑糯米酒。这是由于醇的氧化或脱氢反应能生成醛、酮、酸，故黑糯米保健酒在生成更多醛、酮、酸类化合物的同时，其醇类化合物含量下降。

黑糯米保健酒主体风味成分中含量最大的物质分别是乙醇、1,3-二羟基丙酮、5-（羟甲基）糠醛和乙酸。其中，乙醇含量直接关系到酒精浓度，而长期饮用酒精度过高的酒易导致一系列疾病，如酒精性肝病[7]、酒精性心肌病[8]等。二羟基丙酮是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，可食用且对人体和环境无毒害，是一种具有多功能的添加剂，可用于化妆品、医药及食品行业[9]。5-（羟甲基）糠醛被证明是补肝益肾作用的物质基础之一[10]。乙酸作为白酒中主要的挥发性酸和调味酸，是构成白酒香气的主要物质之一[11]。

2.2 两种黑糯米酒UHPLC-QE-MS结果分析

采用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱联用（UPLC-QE-MS）仪对黑糯米酒和黑糯米保健酒的化学成分进行鉴定，总离子流色谱图见图3和图4。两种酒的化学成分类别及相对含量见表4。

图3 黑糯米保健酒中化学成分UPLC-QE-MS检测基峰色谱图Fig.3 Base peak chromatogram of chemical components in glutinous rice health wine analyzed by UPLC-QE-MS

图4 黑糯米酒中化学成分UPLC-QE-MS检测基峰色谱图Fig.4 Base peak chromatogram of chemical components in glutinous rice wine analyzed by UPLC-QE-MS

表4 黑糯米酒与黑糯米保健酒中化学成分UPLC-QE-MS分析结果Table 4 UPLC-QE-MS analysis results of chemical components in black glutinous rice wine and black glutinous rice health wine

由表4可知，从两种酒中共检出534种化学成分，黑糯米酒含有527种化学成分，黑糯米保健酒含有529种化学成分。其中，黑糯米酒有一种特有氨基酸类物质，黑糯米保健酒有三种特有物质，包括两种黄酮类和一种酸类物质。将所有化学成分分为低聚肽、氨基酸、黄酮、酚、醇、酸、酮及其他共8大类。除其他类外，两种酒中含量最多的是氨基酸，其次是酸类和低聚肽；而物质种类最多的是低聚肽，其次是氨基酸和酸类。另外，两种酒中仅黄酮类物质变化巨大，峰面积增长倍数超过30倍，其余几类物质含量变化较小。

两种酒中存在大量的氨基酸是由于富含蛋白质的黑糯米在经过浸泡、蒸煮、发酵后，大部分蛋白质水解为氨基酸。氨基酸不仅是合成蛋白的重要原料，而且为生长代谢提供了物质基础[12]。如苯丙氨酸是参与肾及膀胱功能修复的主要物质[13]；异亮氨酸参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节及代谢，脑下腺属总司令部，作用于甲状腺、性腺；赖氨酸不仅是肝、胆的组成成分同时还能促进大脑发育及脂肪代谢；色氨酸可促进胃液及胰液的产生；蛋氨酸（甲硫氨酸）可抑制霉菌，有着解毒的功能。无论哪一种氨基酸对于人体来说都是非常重要的，缺乏任何一种就会影响人体代谢的运行，导致疾病。与氨基酸相比，低聚肽的含量较低是因为黑糯米中仅有小部分蛋白质水解为分子质量更小的肽类物质。由≤10个氨基酸构成的小分子肽称为低聚肽，也叫做寡肽，其具有较高的保健功能。研究发现，低聚肽具有增强机体免疫[14]、缓解疲劳、抗氧化、减轻慢性炎症等功能[15]。鲍雷等[16]研究发现，吉林人参低聚肽可提高小鼠的性功能，显著增加其性器官脏器指数。

酸类物质在两种酒中均占其物质总量的20%左右，其中含量最大的是L-乳酸，分别占黑糯米酒和黑糯米保健酒中酸类物质总量的38.805%和45.441%。酸类物质能与醇类物质反应生成相应的酯类物质，从而赋予酒体香味。乳酸是一种天然有机酸，酿造过程中存在适宜浓度的乳酸既能降低pH促进糖化，又有利于酵母发酵，从而提高产品的质量和风味[17]。

黄酮类化合物有提高动物机体抗氧化及清除自由基的能力，可对人体肾脏起到一定的保护作用。在肾脏疾病发展过程中，氧化损伤是非常重要的一个因素，例如损伤肾小球基底膜、引起炎性反应和血小板聚集等相关肾脏疾病都与其息息相关[18]。由于氧化应激而引发的糖尿病肾病[19-20]以及肾小球和肾小管实质细胞凋亡导致肾功能的不断恶化[21]，使得黄酮类化合物用作天然抗氧化剂来防治糖尿病的并发症备受关注[22]。李海山等[23]发现类黄酮物质可降低染铂大鼠肾损伤，或与其抗氧化活性相关。研究表明，糖尿病大鼠在经酸枣仁黄酮干预后，其氧化应激造成的肾损伤得到减轻，酸枣仁黄酮可抑制肾细胞凋亡，从而减轻肾损伤时的结构改变[24]。

结果表明，黑糯米保健酒的特有成分为雌马酚、大豆苷元和甘草酸；黑糯米酒的特有成分为黄嘌呤。雌马酚是大豆异黄酮的代谢产物，生物活性广泛，具有抗氧化作用、免疫调控功能和保健功能。大豆苷元同属于黄酮类化合物，是异黄酮的一种，研究发现大豆苷元可以有效的防止骨质疏松，防治前列腺癌，并可以降低对酒精的依赖度。甘草酸又称甘草皂苷，是从天然植物甘草中提取的，是甘草的主要活性成分。动物实验研究证实甘草酸对缺血再灌注性、梗阻性、高血糖性、药物性（马兜铃酸、庆大霉素、顺铂、阿霉素、镉等引起的）、变态反应性肾损伤都有保护作用，临床研究肯定了甘草酸在治疗肾综合征出血热中的疗效[25]。黄嘌呤是嘌呤降解途径的产物，并会在黄嘌呤氧化酶的作用下转换为尿酸。故黑糯米保健酒中高含量的尿酸可能是由于其中的黄嘌呤全部转化为尿酸。

相较于黑糯米酒，黑糯米保健酒中含量较大的成分有羟基香豆素和乙酰胆碱。羟基香豆素具有较强的解痉、镇痛作用，同时也能温和、持续地促进胆汁分泌，加强胆囊收缩和抑菌作用，具有明显的利胆作用，还有利于结石排出，对胆总管结石有一定排石效果。临床上主要用于胆囊炎、胆道感染、胆结石、胆道术后综合征。乙酰胆碱是一种神经递质，中枢胆碱能系统与学习、记忆密切相关，乙酰胆碱是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一，其主要功能是维持意识的清醒，在学习记忆中起重要作用。

3 结论

通过GC-MS检测到黑糯米保健酒中含有44种挥发性物质，主体风味成分为醇类（39.519%）、酮类（19.467%）、醛类（15.075%）和酸类（9.611%）；黑糯米酒中共检测到47种香气成分，其主体风味成分为醇类（57.284%）、醛类（13.161%）和酮类（11.36%）。黑糯米保健酒的醛、酮、酸类化合物含量高于黑糯米酒，而醇类化合物含量低于黑糯米酒，这是因为醛、酮、酸类物质来源于醇类物质的氧化或脱氢反应。

通过UPLC-QE-MS从黑糯米保健酒中共检出529种化学成分，主体化学成分为氨基酸（42.671%）和酸类（20.383%）；从黑糯米酒中检出527种化学成分，其主体化学成分同样是氨基酸（37.708%）和酸类（18.431%）。与黑糯米酒相比，黑糯米保健酒中黄酮类物质含量增加30余倍，其特有成分为雌马酚、大豆苷元和甘草酸，含量较大的成分有羟基香豆素和乙酰胆碱。