利用猴头菌发酵大果山楂汁的条件优化研究

张 巧，陈春喜，吴天保

（1.贺州学院 食品与生物工程学院，广西 贺州 542899；2.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西 贺州 542899；3.广西果蔬保鲜和深加工研究人才小高地，广西 贺州 542899）

大果山楂（Crataegus pinnatifidaBge.var.major N.）又名乌蝉子（广西苗语）、麻缺顿、墨鸡屯（广西壮语），是由小果南山楂经选育嫁接而成的药果兼用树种，是广西的特色农产品之一[1]。与普通山楂相比，大果山楂果粒大，易加工与储藏，鲜食味道可口且营养丰富[2]。大果山楂医用价值较高，具有开胃健胃、增强心肌收缩力、防止心率紊乱、降压利尿和镇静等作用，在降血脂、降血糖、抑菌、抗肿瘤等方面均有一定的功效[3-5]。

猴头菇（Hericium erinaceus）是一种珍贵的药食兼用的大型真菌，具有抗衰老、降血脂、抗肠胃溃疡、提高免疫力和抗肿瘤等作用，在治疗胃溃疡、慢性胃炎等胃部疾病方面效果明显，其活性成分主要是猴头菇多糖[6-8]。目前市面上的猴头菇产品主要是以猴头菇子实体为原料，制成猴头菇饼干、猴头菇饮料以及一些猴头菇营养汤料等[9]。这些产品虽然具有猴头菇丰富的营养价值，但野生猴头菇资源有限，人工栽培周期长、产量低。而猴头菌的液体发酵可以在短时间内获得大量的菌丝体和发酵产物，且成本低，工艺简单，是一种获取猴头菇营养价值的重要手段[10]。

本研究结合大果山楂和猴头菇丰富的营养及保健价值，以大果山楂汁为主要培养基原料，对猴头菌的发酵条件进行优化，为大果山楂猴头菇饮料的开发和生产提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猴头菌：广东省微生物菌种保藏中心；大果山楂：贺州市水果建材批发市场；果胶酶（酶活力3万U/g）、酸性纤维素酶（酶活力1万U/g）：山东苏柯汉生物工程股份有限公司；硫胺素：上海源叶生物科技有限公司；浓硫酸：西陇化工股份有限公司；苯酚：成都市科龙化工试剂厂。所有实验试剂均为分析纯。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseagar，PDA）：20%马铃薯汁1 L，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，115℃高压灭菌20min。

1.2 仪器与设备

JYZ-D526九阳榨汁机：九阳股份有限公司；KDC-40低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；ZWYR-2012C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；DL-CJ-2N型超级洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；KRQ-250A人工气候箱：上海齐欣科学仪器有限公司；722N可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；FJ200高速分散均质机：上海标本模型厂。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

（1）菌种的活化

用接种铲从猴头菌斜面上切出1～2块1 cm2的菌丝块转接到PDA斜面培养基的中间，菌丝朝上，于26℃的培养箱里培养10～25 d，直至菌丝满管。活化2～3代，使菌株活力达到最强。

（2）种子液的制备

将活化后的猴头菌接种至PDA液体培养基中，培养温度26℃，培养时间为7～10 d，待用。

1.3.2 大果山楂汁的制备

挑选新鲜、无损伤的完整大果山楂，经清洗沥干后切块去核，加入到0.3%的抗坏血酸溶液中进行护色，其中山楂果肉∶护色液=1∶1.5（g∶mL），打成匀浆，分别加入匀浆质量0.3%的果胶酶和纤维素酶，混匀后放入45℃的恒温水浴锅中搅拌酶解2.5 h，然后在沸水中加热灭酶5 min，立即用冷水冷却至室温，过滤。在滤液中加入5 g/L的白砂糖，分装，装液量60 mL/250 mL，密封，于80℃的恒温水浴锅中保温15 min进行灭菌。

1.3.3 发酵液中多糖的提取及测定

第三，通过完善“互联网+”的建设，使基础信息数据具有整合性的特质，从而保证数据的方向型传输。进而使数据的收集、数据的运用、数据的储存能在校园数据库中进行整合、分析和处理。特别是需要根据“互联网+”的功能分层做出相应调研，使教学、管理和信息的传递功能不会因数据的混乱而造成整合发生偏差。

多糖的提取[11]：取一定量的发酵液，使用高速分散均质机（直径12 cm，10 000 r/min）均质5 min，使猴头菌菌丝断裂，在冰浴条件下进行超声波破碎菌丝（200 W，超声1 s，停2 s，总时间30 min），离心（10 000 r/min，10 min），取10mL上清液，加入30mL的预冷体积分数为95%的乙醇，4℃条件下放置过夜。离心（8000r/min，20min），沉淀用体积分数为75%的预冷乙醇清洗表面，室温放置1 h，待表面乙醇完全挥发，用2mL蒸馏水溶解均匀，离心（10 000 r/min，10 min），测定上清的多糖含量。

多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法[12]进行测定。取稀释样液1 mL，加入0.5 mL的5%苯酚，摇匀后加入2.5 mL的浓硫酸，混合均匀，沸水中加热20 min，立刻取出置于冷水中冷却至室温，测定其在波长490 nm处的吸光度值。采用0～1.0 mg/mL的葡萄糖溶液制备标准曲线，得线性回归方程：y=1.432x-0.005，R2=0.999，根据葡萄糖标准曲线回归方程计算发酵液中形成的多糖，其含量计算公式如下：

C=C1-C0

式中：C为发酵液中形成的多糖含量，mg/mL；C1为发酵液中的多糖含量，mg/mL；C0为初始大果山楂汁的多糖含量，mg/mL。

1.3.4 菌丝湿质量的测定

将猴头菌发酵液离心（8 000 r/min，20 min），去掉上清，将离心管室温下倒置2h，待管壁周围水分蒸发完全，称质量。

1.3.5 单因素优化试验

在酶解后的大果山楂汁中分别添加0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L的白砂糖，混匀后进行分装灭菌，分别接种2%、4%、6%、8%、10%的猴头菌种子液，分别在22℃、24℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃，转速120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min的条件下发酵10 d，测定发酵液中形成的多糖含量和菌丝湿质量。

1.3.6 发酵条件优化正交试验

在单因素试验结果的基础上，设计4因素3水平正交试验进行优化，从而确定猴头菌发酵大果山楂汁的最优条件。

表1 猴头菌发酵条件正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization byHericium erinaceus

2 结果与分析

2.1 白砂糖添加量对多糖含量及菌丝湿质量的影响

山楂的营养组成特点是酸高，而糖含量相对较低[13]。李宇伟等[14]研究果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、麦芽糖等碳源对猴头菌液体培养产多糖的影响发现，蔗糖是最合适碳源。因白砂糖的主要成分是蔗糖，且经济易得，因此本研究选定白砂糖作为大果山楂汁中添加的碳源，以促进猴头菌的生长。大果山楂汁中白砂糖的添加量对多糖含量及菌丝湿质量的影响见图1所示。

图1 白砂糖添加量对多糖含量及菌丝湿质量的影响Fig.1 Effect of sugar addition on polysaccharide content and mycelium wet weight

由图1可知，在一定范围内，随着白砂糖添加量的增加，发酵液中形成的多糖及菌丝不断增加，当白砂糖添加量达到10 g/L时，多糖含量与菌丝湿质量最高，说明大果山楂汁中的白砂糖得到了很好的利用，促进了猴头菌的生长及多糖的形成。当白砂糖添加量＞10 g/L之后，多糖含量及菌丝湿质量均开始下降，可能原因在于较高浓度的糖溶液，发酵液的渗透压较大，对猴头菌的生长产生了一定的抑制作用。因此，大果山楂汁中白砂糖的最适添加量为10 g/L。

2.2 发酵温度对多糖含量及菌丝湿质量的影响

菌体的生长发育是一系列酶促反应的结果，温度能通过酶的活性调节、氧的溶解等因素影响发酵，因此温度是影响猴头菌发酵产多糖及形成菌丝的重要因素[15]。发酵温度对多糖含量及菌丝湿质量的影响见图2所示。

图2 发酵温度对多糖含量及菌丝湿质量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由图2可知，在22～26℃时，随着发酵温度的升高，发酵液中的多糖含量及菌丝湿质量也不断增加，提高温度有利于促进猴头菌的生长及多糖的形成。当发酵温度＞26℃之后，多糖含量和菌丝湿质量均开始下降，因此，确定猴头菌在大果山楂汁中进行发酵的最适温度为26℃。

2.3 转速对多糖含量及菌丝湿质量的影响

转速大小与溶氧有一定的关系，在一定范围内，转速越高越利于改变溶氧效果，从而影响发酵液中猴头菌的生长发育。转速对多糖含量及菌丝湿质量的影响见图3所示。

图3 转速对多糖含量及菌丝湿质量的影响Fig.3 Effect of rotation speed on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由图3可知，当摇床转速为160 r/min时，发酵液中的菌丝湿质量及多糖含量较高。当转速＜160r/min之前，溶氧过少不利于猴头菌的生长；当转速＞160 r/min之后，子实体与菌丝容易结团，抑制菌丝生长[16]。因此，确定猴头菌在大果山楂汁中进行发酵的最适转速为160 r/min。

2.4 接种量对多糖含量及菌丝湿质量的影响

种子液接种量也是影响猴头菌发酵的重要因素，适量的接种量有利于促进菌丝的生长及猴头菇多糖的形成。接种量对多糖含量及菌丝湿质量的影响见图4所示。

图4 接种量对多糖含量及菌丝湿质量的影响Fig.4 Effect of inoculum on polysaccharide content and mycelium wet weigh

由图4可知，接种量在0～6%范围内，随着接种量的增加，大果山楂汁发酵液中的多糖含量也随之增加，当接种量＞6%之后，多糖含量随接种量增加反而下降，原因可能在于，接种量过高，猴头菌对发酵液中多糖的消耗大于多糖的形成；此外，在0～10%范围内，接种量增加，猴头菌菌丝湿质量也随之提高，当接种量＜6%之前，增长速率较快，当接种量＞6%之后，增长速率趋于平缓。因此，确定猴头菌在大果山楂汁中进行发酵的最适接种量为6%。

2.5 发酵条件优化正交试验

根据单因素试验结果，以白砂糖添加量、发酵温度、转速、接种量设计4因素3水平正交试验L9（43），以发酵10 d后的多糖含量及菌丝湿质量为考察指标，确定猴头菌在大果山楂汁中的最佳发酵工艺，正交试验结果见表2。

由表2的极差分析可知，以多糖含量为评价指标时，各因素对多糖含量的影响大小是A＞D＞B＞C，即白砂糖添加量影响最大，接种量次之，然后是发酵温度，最后是转速，最优组合是A2B2C2D3；以菌丝湿质量为评价指标时，各因素对猴头菌丝湿质量的影响大小是A＞D＞B＞C，即白砂糖添加量影响最大，接种量次之，然后是发酵温度，最后是转速，最优组合是A2B2C1D3。由直观分析可知，多糖含量及菌丝湿质量最高的条件是A3B2C1D3，对试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3的方差分析结果表明，白砂糖添加量对多糖含量影响极显著（P＜0.01），对菌丝湿质量影响显著（P＜0.05），而接种量对多糖含量及菌丝湿质量均有显著的影响（P＜0.05）。此外，发酵温度和转速对多糖含量及菌丝湿质量则无显著影响（P＞0.05）。

表2 发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

根据各因素的最优水平，产多糖的最优组合为A2B2C2D3，产猴头菌菌丝的最优组合为A2B2C1D3，直观分析结果为A3B2C1D3，在这三个条件下进行发酵组合验证试验，每组三个平行并计算平均值，验证结果确定猴头菌在大果山楂汁中的发酵条件最优组合是A2B2C2D3，即白砂糖添加量为10 g/L，发酵温度为26℃，转速为160 r/min，接种量为8%，此条件下，多糖含量达到5.91 mg/mL，菌丝湿质量达到255.86 mg/mL。

3 结论

通过多个单因素和正交优化试验对猴头菌在大果山楂汁中的发酵条件进行优化，确定最佳的发酵条件：大果山楂汁中白砂糖的添加量10 g/L，发酵温度26℃，摇床转速160r/min，接种量8%。在此优化条件下，猴头菌发酵10d，发酵液中的多糖含量达到5.91 mg/mL，菌丝湿质量达到255.86 g/mL。此研究确定了猴头菌在以大果山楂汁为主要原料进行发酵的工艺条件参数，为大果山楂猴头菇发酵饮料的开发和生产提供重要的研究基础。