猪苓苓种质量分级的初步研究

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(1.河北农业大学农学院/河北省作物生长调控实验室，河北 保定 071001；2.河北省涞源县崟茂猪苓种植场，河北 涞源 074300)

猪苓[Polyporusumbellatus(Pers.)Fr.]为药用真菌，又叫豕苓、猪茯苓、野猪屎、地乌桃，分类学上属于无隔担子菌亚纲(Holoba-sidiomycetidae)、无褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、多孔菌属(Polyporus)[1]。其性平，味甘淡，具利水渗湿的功效，用于水肿，淋浊，泄泻，带下和小便不利[2]。随着以猪苓为原料的成品药如猪苓多糖注射液、猪苓汤、猪苓散等不断开发，野生猪苓已不能满足原料药材需求，人工栽培猪苓一定程度上缓解了猪苓药材的供需紧张状况。目前人工栽培猪苓主要是无性繁殖(即用猪苓苓种做繁殖材料，与蜜环菌伴栽，苓种得到蜜环菌提供的养分后菌丝迅速繁殖，突破菌核表皮层，长出白色幼小的苓头并不断增大，形成新的猪苓)，如果苓种质量不合格，或者使用退化苓种均可能导致接菌率低或空窝。因此，开展猪苓苓种质量的调查研究，制定相应的苓种分级指标，可有效规范猪苓苓种市场，为猪苓人工栽培提供有力保证。

表1 猪苓苓种样品来源

批次苓种产地及生长方式批次苓种产地及生长方式1涞源县崟茂猪苓种植场 仿野生3年7涞源县留家庄乡坡水村 野生多年2涞源县崟茂猪苓种植场 仿野生4年8涞源县留家庄乡小道村 野生多年3涞源县崟茂猪苓种植场 仿野生5年9涞源县留家庄乡团圆村 野生多年4赤城县样田乡双山寨村 仿野生2年10涞源县留家庄乡石片村 野生多年5赤城县样田乡双山寨村 仿野生3年11涞源县上庄乡横山岭村 野生多年6涞源县留家庄乡伊家铺村 野生多年12涞源县东团堡乡箭杆河村 野生多年

关于猪苓苓种的质量，多凭形态评判质量优劣和人工挑选苓种。张世荣认为，苓种应选择表面凹凸不平，多疤状，色泽鲜艳，手捏有弹性，鲜嫩不干浆，生活力强，出芽快而多的灰苓或者黑苓做种；白苓易腐烂，不能做种[3]。王天媛等认为，年幼生命力强，断面菌丝白色，含水率大，萌发新点多的灰苓适合作苓种[4]。陈文强等认为，具弹性、断面菌丝为白色或微黄色、新鲜无霉变的黑苓也可作苓种[5]。综上，生产中猪苓苓种质量良莠不齐，目前尚无苓种质量的检验规程，缺乏具体的质量评价指标。本试验广泛收集河北省涞源、赤城等不同批次的猪苓苓种样品，参考淮山药[8]、怀地黄[7]、姜黄[8]、知母[9-10]等种苗质量分级研究方法，测定分析猪苓苓种的单苓鲜重、密度、色泽、硬度、苓种活力、含水率等指标，初步确定猪苓苓种的质量分级指标，为猪苓苓种的质量评价和生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试猪苓苓种样品来源于不同产地和不同生长年限的12批次猪苓苓种(详见表 1)，经河北农业大学杨太新教授鉴定为多孔菌科猪苓。

1.2 试验仪器

LX-C型邵氏硬度计，CR-400色差计，DHG-9240 A电热恒温鼓风干燥箱，BS-223 S电子分析天平，HCP-100手提式高速中药粉碎机，BIC-250型智能光照培养箱，MLS-3750型高压蒸汽灭菌器，HS-1300-U洁净工作台，游标卡尺，干燥器，刀片，镊子，吸水纸，无菌棉，铝盒，培养皿，溢流杯，量筒等。

1.3 试验方法

采用随机取样法，每批次样品选取具有代表性苓种30个，逐个测定其单苓鲜重、密度[11]、色泽[12-13]、硬度[14]、苓种活力和含水率等指标。

单苓鲜重：将苓种表面清洗干净，用吸水纸吸干表面水分，然后用千分之一电子天平进行称量。

密度：借助阿基米德原理(浮力法)测量，将苓种浸入盛满水的溢流杯中，溢出的水用量筒接取，读数为苓种体积；苓种密度为单苓鲜重与对应苓种体积的比值。

色泽：使用色差计进行测定，以白陶瓷板为标准值校准后，对苓种断面(将苓种切出直径约2 cm的断面)进行色泽测定，结果包括L*、a*、b*值。L*代表苓种断面亮度，L*的取值范围为0～100，L*越小越接近黑色，L*越大则越接近白色；a*代表苓种断面红绿度，a*=0时为灰色，+a*表示红色，-a*表示绿色；b*代表苓种断面黄蓝度，b*=0时为灰色，+b*表示黄色，-b*表示蓝色。

硬度：将硬度计垂直于切出的断面，在均匀力的作用下将压头压入，以此时指针的读数作为苓种的硬度值，重复6次，取平均值作为该苓种的硬度值。

苓种活力的测定：将猪苓苓种清洗干净，放入0.2%的金霉素溶液中浸一下，立即取出，用无菌棉擦干净，然后按无菌操作要求，用刀片从猪苓苓种中间切开，用无菌镊子在菌核中央挑取一块0.3 cm大小的菌肉[15]，迅速将其放于制备好的PDA培养基上，置于(23±2)℃[16]条件下培养。分别在第15天和第30天测量菌落直径，以菌丝体日均生长速度(15 d内菌落直径的生长量除以15)为评价活力的指标。

含水率的测定：将挑取菌丝后的苓种用粉碎机粉碎，置于已知重量的小铝盒内，半盖盒盖，用电子天平称重记录后，置于(103±2)℃的恒温烘箱内。7 h后取出，盖好盖子，放入装有硅胶的干燥器中，打开盖子，冷却至室温，盖好盒盖，取出称重，进行含水率计算。

苓种含水率(%)=[(W2-W3)/(W3-W1)]×100%(式中：W1为小铝盒重量；W2为小铝盒和新鲜猪苓样品的总重量；W3为小铝盒和干样品的总重量)。

1.4 数据分析与等级划分

试验结果采用SPSS 22.0软件进行参数统计分析描述和主成分分析，确定猪苓苓种质量分级指标。

对苓种活力和苓种断面亮度L*2个指标进行K-聚类并得到聚类结果，对苓种断面黄蓝度b*指标采用种苗参数标准差法[17](以平均值加1倍的标准差作为三等苓种的上限点，平均值作为二、三级的分界点，以平均值减1倍的标准差作为一、二级苓种的分界点)得到b*的等级划分结果。最后综合K-中心聚类的聚类结果和种苗参数标准差法的等级划分结果并结合生产实际，制定出猪苓苓种质量指标的最终分级结果。

2 结果与分析

2.1 猪苓苓种分级指标的确定

2.1.1 猪苓苓种质量指标的测定结果

12批次猪苓苓种的单苓鲜重、密度、硬度、含水率、色泽和苓种活力等指标测定结果如表2所示。猪苓苓种的质量指标以苓种断面红绿度a*变化最大，变异系数为0.545，变化范围为0.45～9.62；其次是单苓鲜重，变异系数为0.446，变化范围为9.032～40.119 g；再次是苓种活力，变异系数为0.414，变化范围为0.03～0.631 mm/d；密度、硬度、含水率和苓种断面黄蓝度b* 4个指标的变异系数均较小，在0.217～0.271之间；苓种断面亮度L*的变异系数最低，为0.102。

表2 猪苓苓种质量指标的统计描述

指标极小值极大值均值标准差变异系数单苓鲜重(g)9.03240.11917.3207.7290.446密度(g/mL)0.1731.2490.6830.1660.243硬度8.6071.8044.5712.100.271含水率(%)19.6879.0740.1010.760.268苓种断面亮度L*43.8480.7169.617.120.102色泽苓种断面红绿度a*0.459.624.102.240.545苓种断面黄蓝度b*1.1430.0420.344.400.217苓种活力(mm/d)0.0300.6310.3300.1370.414

2.1.2 猪苓苓种质量指标的主成分分析

考察特征值λ>1，并综合考虑方差贡献率确定最优的主成分数。由主成分分析结果(表3)可见，前3个特征值的累计贡献率已达68.357%，故取前3个为主成分。说明前3个主成分基本包含了猪苓苓种的大部分指标信息。

取前3个特征值，由主成分的载荷矩阵计算主成分特征向量和特征根(表 4)，得到以下3个主成分表达式：

F1=0.051×单苓鲜重+0.256×密度+0.048×硬度+0.285×含水率-0.481×L*+0.376×a*+0.541×b*-0.544×苓种活力；

F2=-0.193×单苓鲜重+0.638×密度-0.709×硬度-0.024×含水率-0.036×L*-0.151×a*-0.132×b*+0.107×苓种活力；

F3=0.851×单苓鲜重+0.023×密度+0.200×硬度+0.229×含水率+0.223×L*+0.041×a*+0.221×b*+0.285×苓种活力。

表3 主成分变量解释

主成分方差贡献贡献率(%)累积贡献率(%)12.98337.28437.28421.44218.02655.3131.04413.04768.35740.9111.37179.72850.7919.89189.61960.3924.90294.52170.3734.65799.17880.0660.822100

表4 主成分特征向量和特征根

项目特征向量特征根主成分123123单苓鲜重0.088-0.2320.870.051-0.1930.851密度0.4420.7660.0230.2560.6380.023硬度0.0830.8510.2040.0480.7090.200含水率0.4920.0290.2340.2850.0240.229L*-0.8300.0430.228-0.4810.0360.223a*0.650-0.1810.0420.376-0.1510.041b*0.934-0.1580.2260.541-0.1320.221苓种活力-0.940.1280.291-0.5440.1070.285

综上，第1个主成分的方差贡献率最高，又因在第1个主成分表达式中，苓种活力、苓种断面黄蓝度b*和苓种断面亮度L*的系数均较其他几个指标的系数大，因此可以把苓种活力、苓种断面黄蓝度b*和苓种断面亮度L*确定为苓种质量分级的指标。

2.2 猪苓苓种质量指标等级初步划分

采用SPSS 22.0软件进行K-聚类分析，将苓种质量指标中苓种活力和苓种断面亮度L*2个指标聚为3类(表 5)。

表5 猪苓苓种活力和断面亮度L*的最终聚类结果

指标类别1类别2类别3苓种活力(mm/d)0.1640.2480.399苓种断面亮度L*53.9565.3374.34

采用1.4中种苗参数标准差法对苓种质量指标苓种断面黄蓝度b*进行划分，结果见表 6。

表6 猪苓苓种断面黄蓝度b*的划分结果

级别ⅠⅡⅢ苓种断面黄蓝度b*15.9420.3424.74

2.3 苓种质量指标的分级结果

根据猪苓苓种活力和断面亮度L*的最终聚类结果和断面黄蓝度b*的划分结果，并结合猪苓生产中的苓种大小，得到各等级分级结果，见表7。

表7 猪苓苓种质量分级指标

指标ⅠⅡⅢ苓种活力(mm/d)≥0.399≥0.248≥0.164苓种断面亮度L*≥74≥65≥54苓种断面黄蓝度b*≤16≤20≤25单苓鲜重(g)≥10.0≥10.0≥10.0

3 结论与讨论

目前，中药材种子种苗质量分级的研究多见报道[18-22]。猪苓属于真菌类中药材，猪苓苓种质量成为人工栽培猪苓的制约因素，前人研究多凭形态判断苓种质量优劣和人工挑选苓种[3-5]，尚未见苓种质量分级的相关研究。本研究收集不同产地和不同生长年限的12批次猪苓苓种样品，对苓种质量的各指标进行了测定分析，并采用k均值聚类法和标准差法相结合将猪苓苓种初步分为3个等级。一级苓种：苓种活力≥0.399 mm/d，苓种断面亮度L*≥74，苓种断面黄蓝度b*≤16；二级苓种：苓种活力≥0.248 mm/d，苓种断面亮度L*≥65，苓种断面黄蓝度b*≤20；三级苓种：苓种活力≥0.164 mm/d，苓种断面亮度L*≥54，苓种断面黄蓝度b*≤25。且各等级苓种均应：单苓鲜重≥10.0 g。建议猪苓人工栽培时选用一、二级苓种，利于提高苓种接菌率和猪苓产量，该分级结果为猪苓苓种的质量评价和指导猪苓苓种生产提供参考。

本研究通过对猪苓苓种的苓种活力、断面色泽、密度、硬度、含水率、单苓鲜重等指标研究，初步确定了分级的4项指标。苓种活力在一定程度上直接反映了苓种内部菌丝的生活力，这与王天媛等[4]的研究结果一致。苓种断面亮度L*可反映苓种菌丝白色程度，苓种断面黄蓝度b*可反映苓种菌丝的黄色程度，均能够反映苓种生活力高低，这与陈文强等[5]的研究结果一致。单苓鲜重反映苓种的大小，也与苓种含水率密切相关，生产中可进行人工控制，单苓重较大时人工栽培的用种量大，生产成本高，较小则影响苓种的接菌率和猪苓产量，因此也将其作为分级指标之一。关于猪苓苓种质量的其他指标及其与质量的相关关系有待进一步探讨。