尿液标志物诊断膀胱癌的研究进展△

朱金锋 综述，王小林审校

南通市肿瘤医院泌尿外科，江苏 南通 2263610

膀胱癌占中国泌尿生殖系统肿瘤发病率的第1位，据2015年中国癌症年报统计，2015年中国约有8.05万新发病例，约3.29万患者死于膀胱癌[1]。膀胱尿路上皮细胞癌（urothelial carcinoma of bladder，UCB）是最常见的组织学类型，占膀胱癌的90%以上[2]。研究显示，近75%的新诊断的膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[2]，根据临床治疗指南，该类膀胱癌通常采用经尿道膀胱肿瘤电切术伴或不伴膀胱内的灌注治疗[3]；其余25%的膀胱癌为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），其标准治疗方法为根治性膀胱切除术和双侧淋巴结清扫术伴或不伴围手术期化疗[4]。研究表明，50%的NMIBC患者5年内复发，多达30%的患者尽管接受了有效的治疗，但最终还是进展为MIBC，导致预后较差[5]。因此，膀胱癌患者需终生严密随访。

膀胱镜检查及尿液脱落细胞学检查仍是膀胱癌诊断的金标准。膀胱镜检查膀胱癌的灵敏度为90%，但它是一种侵入性检查，且费用昂贵，患者对随访的依从性较差[6]。尿液脱落细胞学检查是一种特异度高（99%）的检测方法，但灵敏度较低（34%），特别是诊断低级别肿瘤时灵敏度更低[7-8]，而且受到检查者主观因素的影响。因此，为了提高膀胱癌患者的生活质量和管理水平，许多研究者都在寻找一种非侵入性、高灵敏度和特异度的膀胱肿瘤标志物。尿液是与膀胱癌直接接触的体液，而且可以被大量地非侵入性地收集，尿液标志物检测膀胱肿瘤是未来的发展趋势。迄今为止，美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准将BTA-stat、BTAtrak、NMP22 BladderChek Test、NMP22BC test kit、ImmunoCyt、UroVysion、CxBladder、FDP 等用于临床。这些检测方法与尿液脱落细胞学检查相比，虽然具有较高的灵敏度，但因特异度较差而未能在临床上普及。因此，迫切需要一种特异性标志物用于膀胱癌的早期诊断及术后复发监测。

1 美国FDA已经批准用于临床的尿液膀胱肿瘤标志物

1.1 核基质蛋白22

核基质蛋白（nuclear matrix protein，NMP）是一种蛋白质家族，在细胞核的结构框架中发挥重要作用，并与DNA复制、RNA合成及激素合成有关。核基质蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）是构成细胞核内部框架的装配蛋白，使细胞核内的染色质在有丝分裂期间有规律地分布到子细胞中[9]。有研究表明，膀胱癌患者尿液中的NMP22浓度是健康者的5倍[10]。目前，研究者已经研究出了2种检测尿液中NMP22水平的方法，一种是定量的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），另 一 种 是 定 性 的NMP22 BladderChek试验，后者被应用于床旁检测（point of care，POC）。在NMP22的检测试剂盒上滴几滴尿液，30 min内便可获得结果。这两项测试均已获美国FDA批准用于膀胱癌的监测。一项纳入41项研究、涉及13 885例患者的Meta分析结果显示，NMP22检测膀胱癌的灵敏度为68%，高于尿液脱落细胞学检查的44%，但NMP22检测的特异度低于尿液脱落细胞学检查（79%vs95%）[11]。由于NMP22是一种普遍存在的核蛋白，因此炎性感染、血尿、尿石症或手术创伤都会增加尿中NMP22的释放[12-13]。研究表明，NMP22结合膀胱镜检查可使膀胱癌的复发检出率显著提高，高达99%，而单独使用膀胱镜检查的检出率仅为91%[14]。另有研究表明，肿瘤的级别越高，阶段越晚，NMP22灵敏度越高[15]。因此，NMP22尚不能取代膀胱镜检查在临床中的作用，但通过NMP22检测可以降低膀胱癌术后患者膀胱镜检查的频率。此外，NMP22还适用于高级别膀胱癌的早期检测。

1.2 膀胱肿瘤抗原

膀胱肿瘤抗原（bladder cancer antigen，BTA）是一种膀胱癌细胞产生的人补体因子H相关蛋白。BTA通过打断补体级联反应，使肿瘤细胞具有选择性生长优势，从而逃避宿主免疫系统[16]。尿液BTA常用的检测方法有两种：BTAtrak是一种定量的ELISA检测方法，BTAstat是一种快速特异性试验。研究表明，BTAtrak检测膀胱癌的灵敏度和特异度分别为66%和65%，而BTAstat的灵敏度为70%，特异度为75%[17]。两种检测方法的灵敏度均随肿瘤级别的增加而提高，但特异度仍低于尿液脱落细胞学检查[18]。大部分的假阳性结果是由血尿、良性前列腺增生、感染、炎性反应、结石、卡介苗灌注史和肠道介入史导致的。因为这些良性疾病的干扰，导致BTA的特异度仅为56%[19]。目前BTA的价值有限，很少用于临床决策。

1.3 免疫细胞试验

免疫细胞试验（ImmunoCyt test）是尿液脱落细胞学检查和免疫荧光法的结合，使用3种荧光单克隆抗体检测3种特异性膀胱肿瘤抗原：M344是一种高分子量的癌胚抗原，LDQ10和19A11是与膀胱肿瘤细胞相关的黏蛋白。该测试需要经验丰富的细胞病理医师及大量的脱落细胞才能获得准确的结果。当观察到1个红色或绿色荧光时即为阳性细胞，但制造商建议所有阳性细胞应与形态相关[20]。该测试被美国FDA批准用于对具有膀胱癌病史的患者进行监测。在一项包含10项研究、4199例膀胱癌患者的系统回顾性研究中，ImmunoCyt检测的总体灵敏度为84%，特异度为75%；在低级别的肿瘤中，ImmunoCyt检测的灵敏度高于尿液脱落细胞学检查[11]。在一项包含2217例膀胱癌患者的研究中，Immuno-Cyt检测与尿液脱落细胞学检查联合时，总体灵敏度为73%，1级肿瘤为59%，2级肿瘤为77%，3级肿瘤为90%，但联合检测的特异度仍低于尿液脱落细胞学检查（72%vs98%）[21]。研究表明，作为一种基于细胞的分析，与其他试验相比，ImmunoCyt检测受血尿和炎性反应的影响较小[22]。在一项涉及1182例膀胱癌患者的多中心前瞻性研究中，这些患者既没有膀胱癌病史，也没有无痛性血尿史，ImmunoCyt检测能够很好地预测膀胱癌的发生[23]。尽管如此，ImmunoCyt检测受样品稳定性及制备过程的影响，也受检测者的主观性影响，因此在临床上较少使用。

1.4 荧光原位杂交技术

UroVysion是一种多靶点荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术，能够从尿液脱落细胞中鉴定出最常见的尿路上皮癌细胞3、7和17号染色体的非整倍性以及p16抑癌基因9p21位点的缺失。迄今为止，还没有UroVysion试验阳性的统一标准，但是当观察到至少25个异常细胞中≥4个细胞出现以上染色体改变或≥12个细胞出现9p21位点的纯合子缺失时，通常被认为阳性[24]。该测试已被美国FDA批准用于对有膀胱癌病史的患者进行监测。在一项包含2477项FISH检测的Meta分析中，UroVysion检测膀胱癌的灵敏度为72%，优于尿液脱落细胞学检查，但特异度较低，仅有83%[25]。UroVysion试验在膀胱癌的早期诊断和预后评估中具有无创、灵敏度和特异度高等优点，是早期诊断及监测UCB较为理想的手段，UroVysion试验使用的探针可在同一细胞内同时显示4种遗传学改变，在中国人群中诊断膀胱癌同样具有较高的应用价值。随着此项技术的成熟及试剂成本的降低，相信UroVysion FISH在膀胱癌的早期诊断中将有着广泛的应用前景。

1.5 CxBladder

CxBladder是 基 于4种mRNA（IGFBP5、HOXA13、MDK、CDK1）在膀胱癌患者尿液中显著增加的检测，另一种mRNA（CXCR2）与炎性反应相关，用来减少假阳性率，试验中通过实时逆转录聚合酶链反应（real-time-polymerase chain reaction，RT-PCR）评估这些mRNA的表达。在一项包括485例存在血尿而没有膀胱癌病史的患者的前瞻性研究中，CxBladder检测膀胱癌的灵敏度为82%，特异度为85%[26]。

1.6 纤维蛋白（原）降解产物

纤维蛋白（原）降解产物（fibrin/fibrinogen degradation product，FDP）是在纤溶亢进时产生的纤溶酶的作用下，纤维蛋白或纤维蛋白原被分解后产生的降解产物的总称。肿瘤细胞表面存在多种纤溶酶原激活物受体，该受体与肿瘤细胞产生的纤溶酶原激活物结合，进而激活纤溶酶。激活的纤溶酶分解纤维蛋白原和纤维蛋白，从而产生大量的FDP经尿液排出。有研究发现，FDP诊断膀胱癌的灵敏度和特异度分别为64%和77%[27]。中国的一项研究运用乳胶凝集半定量测定法检测尿液中FDP的水平，结果发现，膀胱癌患者中尿液FDP﹥4 μg/ml占88%，而正常对照组尿中FDP的含量极低，绝大多数﹤2 μg/ml[28]。

2 美国FDA未经批准的膀胱肿瘤标志物

2.1 膀胱癌特异性核基质蛋白

膀胱癌特异性核基质蛋白（bladder cancer spe-cific nuclear matrix protein，BLCA）于1996年由Van Le等[29]首先发现并报道，他们通过蛋白组学的方法提取膀胱癌组织，分别命名为BLCA1-4和BLCA-6。BLCA-4在泌尿系统良性疾病及泌尿系统其他恶性肿瘤中均未被检测出。Konety等[30]采用更为先进的双抗免疫夹心法在大样本中进行检测，获得了类似的结果，膀胱癌检测的灵敏度达89%，特异度达95%。BLCA-4除在膀胱癌组织中表达外，在邻近肿瘤的正常黏膜中也有表达。Myers-Irvin等[31]检测了BLCA-1在膀胱组织及尿液中的表达水平，结果发现BLCA-1在膀胱癌患者的尿液中特异性表达，而在前列腺癌及肾细胞癌患者的尿液中无表达。此外，与BLCA-4在膀胱癌旁正常黏膜中也有表达不同，BLCA-1仅在膀胱肿瘤细胞中表达，提示两者在膀胱癌发生过程中的作用不同。对中国人群而言，尿液BLCA-1和BLCA-4均为具有高特异度及灵敏度的膀胱癌早期诊断标志物。当cut-off值设定为0.0009 OD/μg时，BLCA-1检测膀胱癌可获得良好的效能，灵敏度为92.7%，特异度为 92.9%；cut-off值取 0.00017 OD/μg时，BLCA-4检测膀胱癌可获得最好的效能，灵敏度为97.4%，特异度为100%。尿液BLCA-1检测与膀胱癌的分期、分级无明显相关性，而尿液中BLCA-4的检测对MIBC更有价值[32]。

2.2 存活素mRNA

存活素mRNA是最新发现的一类凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis family of proteins，IAP）成员，可以促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。但与其他家族成员不同的是，存活素mRNA只包含一部分保守的轮状病毒IAP重复结构，而无羧基末端锌指结构。有研究显示，存活素mRNA诊断膀胱癌的灵敏度和特异度分别高达85.71%和90.91%。同时，存活素mRNA的表达与肿瘤的临床分期密切相关，对T1S～T1亚组患者的灵敏度仅为79.55%，明显低于T2～T4亚组患者的100%，差异有统计学意义（P﹤0.05）[33]。说明存活素mRNA的表达水平随着膀胱癌分化程度的降低而逐渐升高，影响肿瘤的恶性程度和发展趋势。

2.3 细胞凋亡标志物

2.3.1 可溶性Fas可溶性Fas（soluble Fas，sFas）是膀胱癌细胞产生和释放的抗凋亡蛋白，可以干扰Fas配体间的相互作用，抑制肿瘤细胞凋亡。sFas在尿液中的水平已被证明是膀胱癌复发的独立预测因子[34]。在一项纳入191例膀胱癌患者的研究中，sFas诊断的灵敏度和特异度分别为88%和89%[35]。与NMP22相比，sFas似乎可以更好地预测膀胱癌及其侵袭能力。

2.3.2 丛生蛋白 丛生蛋白（clusterin）是一种多功能的分泌糖蛋白，在肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用。研究表明，clusterin表达水平在膀胱癌患者的尿液中明显升高[36]。另有研究报道，clusterin诊断膀胱癌的灵敏度为70%～87%，特异度为83%～97%[37]。

2.4 血管生成标志物

2.4.1 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是膀胱癌细胞血管生成的重要介质，在促进肿瘤细胞浸润、转移的过程中具有重要作用。VEGF水平与膀胱癌存在相关性，且随着肿瘤级别的增加而增加。VEGF可能通过旁分泌作用于内皮细胞，刺激内皮细胞增殖，诱导肿瘤血管生成，增加血管通透性，促进肿瘤细胞侵袭转移。因此，随着膀胱癌病理分级与临床分期的增加，VEGF表达水平升高，血管生成能力增强。有研究显示，VEGF诊断膀胱癌的灵敏度为68%～83%，特异度为62%～93%[38]。

2.4.2 白细胞介素 白细胞介素（interleukin，IL）是由白细胞分泌的小信号蛋白，参与免疫系统的炎性反应过程。膀胱癌患者尿液中IL-8的水平明显升高，在普通检测环境中，IL-8检测表现出较高的准确性，在灌注卡介苗后的监测环境中，经历疾病复发的患者尿液中IL-8的水平更高[39]。IL-6/IL-10已被证明可以预测卡介苗应用后的复发和中度风险患者的复发，灵敏度为83%，特异度为76%[40]。虽然血管生成和炎性反应是肿瘤的明确标志，但它们是非特异性的，因此对膀胱癌的诊断或监测意义不大。

2.5 增殖与侵袭相关标志物

2.5.1 端粒酶 端粒酶是真核细胞染色体末端具有稳定DNA序列和防止染色体复制时缩短的功能性异质化结构，对于防止染色体畸变和维持下游基因遗传信息的稳定具有重要意义。端粒酶在绝大多数正常体细胞中呈失活状态，但在膀胱癌发生过程中可被重新激活。目前主要通过端粒重复序列扩增技术和PCR技术检测端粒酶[41]。由于端粒酶活性缺乏特异性，导致其假阳性率较高。

2.5.2 透明质酸 透明质酸是组成细胞外基质的一种黏多糖，与细胞黏附和增殖有关。透明质酸可被透明质酸酶降解成促进血管生成的小片段。两种成分在膀胱癌患者的尿液中都有增加。两者结合后，测试性能优于单独测试，灵敏度为92%，特异度为85%[42]。透明质酸/透明质酸酶的水平与肿瘤级别相关[43]，但还需要进一步的研究来评估该生物标志物的临床效应。

2.5.3 纤维粘连蛋白 纤维粘连蛋白是一种结构糖蛋白，广泛存在于细胞、血浆和细胞外基质中，与细胞的迁移和黏附有关。当出现肿瘤时，细胞外基质的组成部分被蛋白酶降解，为肿瘤的转移或侵袭创造条件。在一项纳入5项研究、649例患者和291个对照组的Meta分析中，纤维粘连蛋白检测膀胱肿瘤的灵敏度为81%，特异度为80%[43]。

2.6 基因相关生物标志物

2.6.1 成纤维生长因子受体 3成纤维生长因子受体 3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）突变可以出现在50%以上的膀胱癌患者中，FGFR3突变是膀胱癌复发的独立预测因子[44]。在低级别膀胱肿瘤中，FGFR3检测的灵敏度为58%，高于尿液脱落细胞学检查[45]。FGFR3检测具有多种用途，包括肿瘤的检测、药物作用的靶点检测和监测治疗反应等。

2.6.2 DNA甲基化 在肿瘤形成的过程中常常伴有DNA异常甲基化。很多基因的CpG岛异常甲基化伴随着膀胱癌的发生发展，在膀胱癌组织标本和患者尿液标本中能检测出多种基因的异常甲基化。Reinert等[46]应用RT-PCR技术对184例非浸润性膀胱癌患者的390份尿沉渣细胞的EOMES、HOXA9、POU4F2、TWIST1、VIM和ZNF154基因的甲基化水平进行检测，灵敏度为82%～89%，特异度为94%～100%。目前甲基化机制在表观遗传学中的研究较为深入，很多抑癌基因的异常甲基化参与了肿瘤的发生和发展。

2.6.3 微RNA 微RNA（microRNA，miRNA）是一种小型的非编码RNA，通过结合mRNA来调节转录后基因的表达。miRNA表达的改变可诱导肿瘤发生，并可通过RT-PCR测量，一些miRNA沉默的表观遗传改变已经显示参与膀胱癌的发展。研究表明，miRNA-137、miRNA-124-2、miRNA-124-3、miRNA-9-3检测膀胱癌的灵敏度为81%，特异度为89%[47]。

3 小结

膀胱镜检查和活体组织检查是临床推荐的诊断膀胱癌最可靠的方法，但具有侵入性且费用昂贵。因此，作为膀胱镜检查及活体组织检查的补充，通过尿液肿瘤标志物辅助检查可以提高膀胱癌的检出率，为膀胱癌的诊断提供安全、简单、无创的检查手段。