牛津杯法测定抗菌肽对四种有害微生物的抑制效果

■周 芳 熊海涛 张 江 柳永刚 宋 凯*

（1.集美大学水产学院，福建厦门361021；2.厦门市饲料检测与安全评价重点实验室，福建厦门361021；3.中国农业大学动物科技学院，北京100000；4.林州中农颖泰生物肽有限公司，河南林州456500）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）与副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）都是嗜盐性革兰氏阴性菌，隶属弧菌科、弧菌属，广泛分布于海水及河口处，均是海水鱼类的主要病原菌，在世界范围内对海水鱼类养殖业造成重大经济损失[1-2]。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于弧菌科，气单胞菌属，是气单胞菌的一种，广泛分布于池水、淤泥、土壤环境中，可感染两栖类、爬行类、鸟类等动物，同时也是多种水产动物的致病菌，能引起腹泻和败血症[3-4]。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人类化脓感染中最常见的革兰氏阳性菌，也是最常见的食源性致病菌之一[5]。抗菌肽（Antimicrobial peptides,Amps）是生物体内经诱导产生的一类具有抗菌生物活性的小分子短肽，广泛来源于植物、动物、微生物中，因其具有杀菌高效性、广谱性和不易产生耐药性的优点而被广泛使用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞以及某些病毒，在动植物病害防治方面也日益受到人们关注[6]。抗菌肽相比较其他化学药物或抗生素作为水产饲料添加剂有着广泛的应用前景，目前抗菌肽对这四种水产动物病原菌的抑制作用的研究尚比较少，本试验采用牛津杯法来测定该抗菌肽对金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌的抑菌效果，以期为抗菌肽作为饲料添加剂在水产养殖领域的广泛使用提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 指示菌

副溶血弧菌(V.parahaenzolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)由集美大学水产学院病理实验室从感染这两种弧菌的凡纳滨对虾体内分离得到。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）由集美大学水产学院营养与饲料教研室提供。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923由林州中农颖泰有限公司提供。

1.1.2 指示菌培养基

LB液体培养基和固体培养基。

1.1.3 抑菌物质和抑菌悬液配制

称取0.512 g粉末状抗菌肽溶入5 ml无菌双蒸馏水中，制成102.4 mg/ml的抗菌肽母液，37℃下超声波处理15～20 min。静置数分钟，然后采用2倍梯度稀释，配制成 51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/ml的样品溶液，调整pH为7.0～8.0，分别编号1～9，4℃保存待用。每种浓度各取0.2 ml用于对四种指示菌的最小抑菌浓度（MIC）的测定，每种浓度四个重复处理。

1.1.4 主要试剂和器材

胰蛋白胨(北京陆桥技术有限公司)、琼脂粉(上海捷瑞生物工程有限公司)、酵母提取物(英国OXOID),氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)等，生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司），牛津杯内径（6.0±0.1）mm，外径（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

往100 ml LB液体培养基分别接种副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌各100 μl后于37℃、150 r/min震荡培养24 h，进行第一次活化；分别取第一次活化好的四种菌液5 ml于已装有200 ml液体培养基的锥形瓶中进行第二次活化，方法同第一次。菌体第二次活化完成后用无菌生理盐水以10倍梯度稀释涂布法（稀释成14个梯度，每个稀释梯度6个重复处理）进行菌落计数。计算第二次活化后的菌液浓度并使金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌四种菌液浓度分别调整至3×1016、1.6×1014、7.5×105、8.5×105CFU/ml用于正式抑菌试验。第二次活化的四种指示菌悬液在4℃冰箱保存备用。

1.2.2 指示菌菌悬液的涂布

取第二次活化好的四种指示菌菌悬液100 μl在固体琼脂平板上均匀涂布，用镊子将无菌牛津杯轻轻放入培养皿，在水平放置的平皿中均匀地放置3个牛津杯，设置无菌水处理作为空白对照组，编号为0，9个浓度梯度的抑菌悬液编号为1～9，分别预先在培养皿边缘做好编号标记，每个浓度梯度做四个重复处理。加入各个浓度梯度的抗菌肽悬液200 μl于相应编号的牛津杯中，注意不要将抗菌肽悬液加满牛津杯，防止抗菌肽悬液溢出牛津杯外。

1.2.3 指示菌的培养和最小抑菌浓度（MIC）的测定将加入抗菌肽悬液的培养皿放置在恒温生化培养箱中37℃条件下扩散24 h，抗菌肽悬液会向培养基内呈球形扩散，指示菌同时在此条件下培养，并开始繁殖。抗菌肽在琼脂培养基中的浓度，随离开牛津杯的距离增大而降低，当扩散到一定时间后，琼脂培养基抗菌肽的浓度恰好高于其对指示菌的最低抑菌浓度，而指示菌繁殖被抑制呈现出透明的抑菌圈，观察抑菌圈大小，拍照并用游标卡尺测量其直径大小，取平均值。此时抑菌圈边缘处的抗菌肽的浓度可视为其对指示菌的最小抑菌浓度（MIC，Minimum Inhibitory Concentration），即能产生透明抑菌圈的最小抑菌剂浓度定为MIC，其判定标准为：在该浓度下抑菌圈直径大于或等于8.0 mm[7]。

2 结果与讨论

表1 牛津杯法测定不同质量浓度抗菌肽的抑菌效果

由表1可知，抗菌肽对金黄色葡萄球菌（3×1016CFU/ml）、副溶血弧菌(1.6×1014CFU/ml)、溶藻弧菌（7.5×105CFU/ml）、嗜水气单胞菌（8.5×105CFU/ml）的最小抑菌浓度分别是0.8、0.8、1.6、3.2 mg/ml。抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，其次是副溶血弧菌、溶藻弧菌，对嗜水气单胞菌的抑菌效果最弱，可知不同细菌对同一种抗菌肽的敏感性程度也不同。这与韩树江[8]的研究结果“黄粉虫抗菌肽对溶藻弧菌的抑制作用＞对副溶血弧菌的抑制作用＞对嗜水气单胞菌的抑制作用”有差别。由表2和图1可知，在一定浓度范围内，随着抗菌肽质量浓度的增加，抑菌圈直径在增加，说明抑菌作用在不断增强。有研究表明[9-10]，抗菌肽相比较中草药提取液及醇提液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更明显。刘付弟[11]的研究结果表明，抗菌肽SThanatin对金黄色葡萄球菌MIC是50 mg/l，低于本试验中抗菌肽对金黄色葡萄球菌的MIC值，说明金黄色葡萄球菌对抗菌肽S-Thanatin的敏感性要强于实验选用的抗菌肽。在周义文等[12]的研究中，家蝇抗菌肽对耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）有一定的抗菌活性，其MIC值为20 μg/ml，又有裴颖等[13]研究表明，泥鳅抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为12.25 μg/μl，说明不同抗菌肽对不同细菌有不同程度的抑制作用，即使对同一种细菌，由于其抗菌肽来源不同，也会产生不同抑菌效果。管淑玉等[14]的研究显示，苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取部分（按生药计）对副溶血弧菌的最小抑菌浓度（MIC）均为50 mg/ml，大于本研究中抗菌肽对副溶血弧菌的MIC（0.8 mg/ml），说明抗菌肽抑菌效果要强于苦楝叶和羊蹄甲叶石油醚萃取物；但在陈琛等[15]的研究结果中，五倍子、诃子提取物对副溶血弧菌的MIC分别为0.06、0.036 mg/ml，低于0.8 mg/ml；黄岑、大黄、乌梅、艾叶、连翘、黄连、牡丹皮、金银花等中草药提取物对副溶血弧菌的MIC分别为0.98、0.98、3.91、3.91、1.95、3.91、1.95、1.95 mg/ml，均高于0.8 mg/ml，表明在对副溶血弧菌敏感性方面，抗菌肽对副溶血弧菌的敏感程度要弱于五倍子、诃子提取液，要强于黄岑等8种中草药提取液。也有研究显示[16]，五味子和黄精水煎液对副溶血弧菌的MIC均为1.56 mg/ml，而本试验中抗菌肽对副溶血弧菌的MIC为0.8 mg/ml，表明在抑菌性方面，抗菌肽的抑菌效果还是要强于五味子和黄精。在相关的研究中发现[17-19]，石榴皮、地榆、五味子、大黄、五倍子、公丁香、黄连、黄精等中草药提取液均对溶藻弧菌有一定的抑菌效果，最小抑菌浓度均高于抗菌肽对溶藻弧菌的MIC值（1.6 mg/ml），表明在抗菌效果方面，抗菌肽优于大多数的中草药。本试验选用的抗菌肽对嗜水气单胞菌的MIC是3.2 mg/ml，相比较罗新等[20]研究五倍子（MIC为7.813 mg/ml）、诃子（MIC为15.625 mg/ml）、黄连（MIC为62.5 mg/ml）、石榴皮（MIC为250 mg/ml）、艾叶（MIC为250 mg/ml）、乌梅（MIC为1 000 mg/ml）等中性中草药药液对嗜水气单胞菌的抑菌效果更好，相比较裴颖等[13]研究泥鳅抗菌肽对嗜水气单胞菌的抑菌活性（MIC为0.195 μg/μl）要弱。为了更有针对性、更有效地利用抗菌肽在微生物饲料添加剂的广泛应用和推广，还须进一步探明其抑菌机理和对其他不同类型菌种的深入研究。

表2 抗菌肽对指示菌的最低抑菌质量浓度

图1 牛津杯法测定不同质量浓度抗菌肽的抑菌圈直径

3 结论

本试验采用牛津杯法获得的抑菌圈质量较高，重复性较好，得到这种抗菌肽对金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌的最小抑菌质量浓度（MIC）分别为0.8、1.6、0.8、3.2 mg/ml，对这四种指示菌的抑菌作用能力由高至低分别是金黄色葡萄球菌＞副溶血弧菌＞溶藻弧菌＞嗜水气单胞菌。