预消化蛋白对小鼠免疫性能的影响

■杨 洋 权志中 吕秋凤* 杨 宁 李晓玲 王 楠 董公麟 吕允涛

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110161；2.沈阳市康普利德生物科技有限公司，辽宁沈阳110161；3.辽宁康普利德生物科技有限公司，辽宁铁岭112611)

蛋白质是动物饲料中非常重要的营养源，但受不同蛋白饲料来源和动物的不同生理阶段(如断奶、疾病、应激条件下)影响，机体对蛋白质的消化、吸收往往存在一定的障碍，因此，对蛋白原料进行体外预消化处理十分必要。饲料预消化处理即采用体外模拟动物消化过程，根据不同原料所具有的不同特征进行一定的加工处理，使其转变成易于动物机体吸收的营养成分，同时消除原料中有毒有害物质，提高机体对营养物质的消化、吸收和利用的一种新型饲料加工技术[1]。

目前对蛋白质在小肠内的消化吸收机制的理论解释中，公认的主流学说是蛋白质在肠道的吸收主要以氨基酸和小肽为主，大分子蛋白必须通过动物机体的酶解作用才能够被小肠吸收利用，这是一个生物耗能过程。研究表明，断奶、疾病等应激条件下，动物肠黏膜形态发生改变、绒毛受损、黏膜细胞能量供应不足，就会引起上皮细胞损伤及其功能紊乱，进而降低机体对营养素的吸能力。饲粮谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸是小肠黏膜的主要燃料，为营养物质转移和细胞内蛋白质周转等肠道ATP依赖性的代谢过程提供能量。通过向猪十二指肠灌注小肽后，血浆胰岛素的浓度高于灌注游离氨基酸，而胰岛素的生理功能之一即参与蛋白质合成中肽链的延伸，增加蛋白质的合成。王恬等[2]研究发现小肽能刺激小肠绒毛增生，促进幼龄动物小肠发育成熟。这些研究提示我们在动物肠道营养中氨基酸和小肽均有作用，且有可能存在互作。蛋白质预消化处理后的产物主要由氨基酸和小肽以及一些生物大分子组成，较早期的研究表明可以改善动物的生长性能，但这些混合成分对肠道健康的影响机制并不清楚。肠道作为消化器官直接与外界相通，而肠道黏膜系统作为机体最大的非特异性免疫器官，其功能状态直接影响机体的免疫水平。因此，研究蛋白质预消化处理产物对肠道组织形态学以及机体免疫能力的影响十分必要。本研究旨在通过观察预消化蛋白对小鼠肠道形态结构、腹腔巨噬细胞吞噬能力、免疫器官指数、肠黏膜SIgA等免疫指标的影响，为预消化蛋白在动物生产中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

预消化蛋白购于沈阳市康普利德生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物

SPF(Specific pathogen free，无特定病原体级)小鼠，体重18～22 g，雄性，购于辽宁中医药大学实验动物中心。

1.2.2 试验设计

试验分组：取小鼠240只，随机分成3组，每组4个重复，每个重复20只。对照组饲喂基础日粮，试验一组的日粮中预消化蛋白添加量为2.5%，试验二组的日粮中预消化蛋白添加量为5%，试验设计见表1。

表1 试验设计

1.2.3 饲养管理

小鼠自由采食，每天换水1次，每周更换垫料2次，消毒2次，环境温度20～30℃。

1.3 测定指标

1.3.1 十二指肠形态学指标测定

试验进行6周后，每个处理的每个重复随机选取3只小鼠，剪取十二指肠中段肠管3 cm，用蒸馏水轻轻洗净内容物后，立即置于固定液中固定。采用HE染色法染色，以IAS.BV4.4图像软件分析，测定绒毛长度和隐窝深度，计算绒毛长度/隐窝深度比值。

1.3.2 小鼠免疫器官指数测定

试验过程中，每周从每个重复组中随机取出1只健康小鼠，称重后采用颈椎脱臼的方法将小鼠处死，分离脾脏和胸腺，用滤纸吸干水分后分别称重，计算免疫器官指数。

1.3.3 小鼠巨噬细胞吞噬能力指标测定

采用台盼蓝染色法，试验饲养周期结束的前2 d，从每个处理组每个重复中随机取3只小鼠，分别用注射器抽取1 ml台盼蓝染色液注入小鼠腹腔内并将小鼠进行标记。试验结束后，抽取上述标记小鼠的腹腔液于镜下观察并记录不同视野下100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被巨噬细胞吞噬的鸡红细胞数。

1.3.4 小肠黏膜SIgA表达水平的测定

试验过程中，每周从每个重复组中随机选出1只小鼠，宰杀解剖后分别切取十二指肠段、空肠段、回肠段各3 cm左右。按照ELISA试剂盒使用说明书通过酶标仪进行测定肠道黏膜SIgA的表达水平。试剂盒购置于德国IBI分装公司。

1.4 数据分析

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，采用IDE和Duncan's法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 预消化蛋白对小鼠十二指肠形态学的影响(见表2、图1)

表2 预消化蛋白对小鼠十二指肠形态学的影响

图1 预消化蛋白对小鼠十二指肠形态的影响

由表2可知，试验组小鼠十二指肠绒毛长度与对照组相比分别提高11.31%和8.84%(P＜0.05)，试验组小鼠十二指肠绒毛长度/隐窝深度与对照组相比分别提高18.32%和14.66%(P＜0.05)，试验组隐窝深度与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，但有降低趋势。试验组之间的小鼠十二指肠绒毛长度、隐窝深度及V/C均差异不显著(P＞0.05)。综上所述，预消化蛋白可以显著提高小鼠十二指肠绒毛长度和绒毛长度/隐窝深度比值(P＜0.05)，有降低隐窝深度的趋势(P＞0.05)。

图1显示，对照组小鼠十二指肠绒毛结构完整，排列疏松，但绒毛长度不均等；试验一组的绒毛结构完整、排列紧密、长度增长且均等、隐窝深度降低；试验二组绒毛结构完整、排列紧密，但绒毛长度不均等。

2.2 预消化蛋白对小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响(见表3)

表3 预消化蛋白对小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响

由表3可知，试验组小鼠巨噬细胞吞噬率与对照组相比均显著提高(P＜0.05)，其中试验一组的吞噬率与对照组相比提高了14.56%，试验二组吞噬率与对照组相比提高了6.27%，且两个试验组之间差异显著(P＜0.05)。但试验组的吞噬指数与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)。

2.3 预消化蛋白对小鼠免疫器官指数的影响(见表4)

表4 预消化蛋白对小鼠免疫器官指数的影响

由表4可知，在整个试验过程中，对照组脾脏指数和胸腺指数逐渐降低，各试验组的脾脏指数先升高后降低，而胸腺指数逐渐降低，但降低速度缓慢。试验一组脾脏指数与对照组相比的优势逐渐增强，并在试验进行6周后优势达到最优，比对照组提高21.00%(P＜0.05)；试验二组在试验进行3周后脾脏指数与对照组相比优势最强，与对照组相比提高14.50%(P＜0.05)，之后降低，但整体均优于对照组；试验组胸腺指数与对照组相比均有提高，其中试验进行6周后试验组胸腺指数与对照组相比分别提高17.69%和13.08%(P＜0.05)。试验结果证明，预消化蛋白能够提高小鼠免疫器官指数，提高机体非特异性免疫水平。

2.4 预消化蛋白对小鼠肠黏膜SIgA的影响(见表5)

表5 预消化蛋白对小鼠肠黏膜SIgA的影响(ng/ml)

由表5可知，试验过程中，小鼠十二指肠黏膜SI-gA表达水平呈现动态变化，前3周逐渐上升，第4周忽然降低后又逐渐上升。总体来看，试验组与对照组相比，除1周后试验二组十二指肠黏膜SIgA表达水平略低于对照组，其余时间段试验组均高于对照组。其中试验进行2周后，试验二组十二指肠肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比有所提高（P＞0.05），并与试验进行的4周后达到显著水平(P＜0.05)，至6周后虽仍高于对照，但差异已趋平缓(P＞0.05)。试验进行2周后，试验一组与对照组相比，十二指肠黏膜SIgA表达水平提高7.89%(P＜0.05)。试验进行3周后，试验一组与对照组相比，十二指肠黏膜SIgA表达水平提高了13.18%(P＜0.05)。试验进行4周后，试验组与对照组相比，十二指肠黏膜SIgA表达水平分别提高了13.78%和6.73%(P＜0.05)。试验进行5周后，试验组与对照组相比，十二指肠黏膜SIgA表达水平分别提高26.19%和9.58%(P＜0.05)。试验进行6周后，试验一组与对照组相比，十二指肠黏膜SIgA表达水提高14.56%(P＜0.05)，在试验进行2周到6周期间，两个试验组之间差异均显著(P＜0.05)。

小鼠空肠黏膜SIgA表达水平的动态变化趋势与十二指肠表现基本一致。试验进行1周后，试验一组空肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比提高了23.85%(P＜0.05)，试验二组空肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。试验进行2周后，两个试验组空肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比分别提高了22.31%和9.14%(P＜0.05)；试验进行3周后，试验一组空肠黏膜SIgA表达水平显著高于对照组，提高5.44%(P＜0.05)，而试验组二空肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，两试验组之间差异不显著(P＞0.05)；试验进行4周后，试验组空肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比分别提高了19.99%和6.37%(P＜0.05)，且试验组之间差异显著(P＜0.05)；试验进行5周后，试验组空肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比分别提高了18.40%和8.93%(P＜0.05)，且试验组之间差异显著(P＜0.05)。试验进行6周后，试验组空肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比分别提高了10.00%和9.29%(P＜0.05)，且试验组之间差异不显著(P＞0.05)。

小鼠回肠黏膜SIgA的变化趋势也与十二指肠表现基本一致。试验进行1周后，试验组回肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比差异不显著(P＞0.05)；试验进行2周到6周中，试验组回肠黏膜SIgA表达水平与对照组相比均显著提高，由2周到6周试验组依次分别提高了11.69%和6.64%(P＜0.05)、24.58%和13.49%(P＜0.05)、18.26%和 17.74%(P＜0.05)、8.41%和 6.87%(P＜0.05)、10.72%和9.86%(P＜0.05)，其中饲喂3周时回肠SIgA表达水平提高最多。

3 讨论

3.1 预消化蛋白对肠道形态学的影响

王恬等[2]在小肽营养素对断奶仔猪小肠发育的影响中研究表明，小肽能刺激小肠绒毛增生,促进幼龄动物小肠的发育成熟。断奶仔猪日粮中添加小肽营养素可以减轻由于仔猪断奶后引起的小肠绒毛萎缩,刺激仔猪肠道组织与功能的发育，改善十二指肠的形态，提高营养物质的吸收。祝平等[3]在植物小肽对断奶仔猪肠道形态的影响中研究表明，植物小肽能够促进仔猪在断奶后肠道形态完整性，提高仔猪肠道绒毛高度与隐窝深度的比值，这种趋势随着植物小肽添加量的增加而提高。这些试验结果与本试验结果具有一致性。本试验结果证明，预消化蛋白可以提高肠绒毛长度和V/C比值，降低隐窝深度，促进肠道形态的完整，进而增强小鼠的免疫能力。

3.2 预消化蛋白对巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响

吞噬细胞的吞噬作用是非特异性免疫的重要组成部分。因此测定机体吞噬细胞的能力对了解机体的免疫功能具有十分重要的意义。

本试验中，预消化蛋白组的巨噬细胞吞噬率均高于对照组，三组之间具有显著差异，且以2.5%组表观更优，李红胜[4]在大豆肽的制备及其小鼠免疫功能的影响中试验结果表明，添加大豆肽可以提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力，与本试验结果表现一致。说明预消化蛋白可以提高巨噬细胞的吞噬能力，提高小鼠自身的非特异性免疫能力。由于非特异性免疫力是特异性免疫的基础，巨噬细胞吞噬能力的增强可以促进血液中免疫球蛋白的表达，继而提高机体的免疫能力。

3.3 预消化蛋白对免疫器官指数的影响

试验过程中，小鼠的脾脏指数呈现动态变化，整体表现平稳，没有大起大落，说明在小鼠的正常生长周期中，不会出现免疫亢进或免疫抑制的情况，免疫功能逐渐完善并趋于稳定。添加预消化蛋白的两组脾脏指数从第2周开始显著高于对照组，且以试验一组表现更优。脾脏是机体中最大的免疫器官，是免疫应答的重要场所。脾脏内富含有B淋巴细胞和浆细胞，产生抗体。B细胞对血清中抗体水平尤其是IgM和IgG的表达水平具有很大作用。

从胸腺指数来看，随着试验的推进呈逐渐降低趋势，这主要与胸腺本身会随年龄增长逐渐退化，最后被脂肪代替相关。但在整个试验过程中，两个试验组的胸腺指数降低速度相比对照组缓慢，且随着年龄增长差异显著，说明预消化蛋白可以延缓胸腺的退化。机体的免疫能力与胸腺的生长周期密切相关，预消化蛋白延缓胸腺的退化，将对小鼠胸腺中T淋巴细胞分化成熟产生抗体起促进作用。

由此可见，预消化蛋白对促进免疫器官健康发育，提高机体体液免疫能力具有积极的作用。

3.4 预消化蛋白对肠黏膜免疫的影响

本试验过程中，小鼠各肠段肠黏膜SIgA呈现动态变化趋势，前3周逐渐上升，但在第4周的时候出现了全群下降，之后又恢复上升趋势，说明小鼠的免疫能力随着年龄的增长逐渐发展和完善，第4周的全群变化可能与气候突变导致应激所致。

试验结果表明，从第2周开始预消化蛋白显著提高了小鼠十二指肠、空肠和回肠黏膜SIgA表达水平，且试验一组效果优于试验二组。杨小军[5]在“灌胃大豆蛋白、面筋蛋白的胃蛋白酶酶解物对大鼠免疫功能的影响”中研究表明，灌喂两种蛋白水解液能显著提高肠腔SIgA水平，与本试验结果表现一致。SIgA是肠道黏膜免疫的核心，本试验结果说明预消化蛋白对小鼠的肠黏膜免疫功能具有促进作用。

4 结论

综上所述，预消化蛋白对小鼠肠道的健康发育和免疫能力具有显著的促进和提高作用，且综合各检测指标的检验结果以2.5%的添加量为宜。