甘油混合条件下微酸性电解水对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌效果评价

吕桂芬，乌云达来，李玉坤，张学礼，赵阳，刘露

（1.内蒙古师范大学生命科学与技术学院，呼和浩特 010022；2.呼和浩特民族学院环境工程系，呼和浩特 010051）

0 引 言

奶牛乳房炎是降低奶牛泌乳量、损害乳质，危害奶牛养殖、制约奶牛养殖业发展的重要因素之一，它不仅会影响奶牛泌乳量，诱发其他疾病，造成消费性饲养，而且重度乳房炎还会造成奶牛丧失泌乳能力，从而使部分奶牛被迫淘汰。奶牛乳房炎除了疾病引起的经济损失，也给人类健康及公共卫生造成巨大危害[1-2]。临床上，对于奶牛乳房炎的预防措施主要是采取乳头消毒，而当前市场上乳头药浴的主流产品为聚维酮碘等碘制剂消毒剂，但长期应用含碘消毒剂，不仅对奶牛存在一定应激性，损害乳品质，同时也存在残留问题，对食品安全也有一定影响[3]。

微酸性电解水（Slightly Acidic Electrolyzed Water,SAEW）是在无隔膜电解槽内将一定比例的低浓度氯化钠和稀盐酸电解生成。其p H介于4.5～6.5之间，有效氯以HClO形态存在，杀菌力强，作用后可迅速分解且无化学污染[4]。SAEW对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、流感病毒、口蹄疫病毒、禽流感病毒和猪蓝耳病毒等各类微生物均有较强的杀灭作用[4-5]。目前SAEW在食品、医疗领域已有广泛的应用[6-10]。与其他化学消毒剂相比，SAEW杀菌后可完全还原成无毒、无残留的普通水，排放后对环境无任何污染，对生态环境不会造成危害，而且其制作成本低廉，使用简单方便[11]。荒井等人使用强酸性电解水消毒奶牛乳头得到比较好的结果[12]，南松剑等人使用微酸性电解水冲洗奶牛乳房，除菌率达到93%[13]。但单独使用酸性电解水药浴乳头，药浴后蒸发较快，作用持续时间短，冬季乳头干裂或冻裂的可能。甘油具有无毒、保湿、防冻功效，普遍适用于化妆品行业[14]，本研究利用SAEW的杀菌能力强、无毒无害、低成本、对环境友好等优点和结合甘油的保湿、防冻等特点，开发一种安全、有效、低成本并且能够保护乳头的乳头药浴新方法。

1 方 法

1.1 微酸性电解水（SAEW）的制备

微酸性电解水（SAEW）的制备使用本实验室自制的无隔膜酸性电解水装置，按照自来水、氯化钠、盐酸的质量比1∶0.5%∶0.1%混合，充分搅拌均匀，然后置于酸性电解水发生器的电解槽中，在电压为25 V、电流为1.5 A、电极距为2.5 mm、极板面积为108 cm2进行电解反应20 min，使用稀HCl和NaOH微调节pH值，通过蒸馏水稀释方法获得实验所需的有效氯浓度（ACC），即得药浴剂中使用的SAEW。SAEW的有效氯（ACC）的测定采用碘量法。

1.2 甘油对SAEW的ACC和pH的影响

取ACC为60 mg/L的SAEW，分别加入体积百分比3%和10%的甘油，存储于1.5 L塑料瓶中，塑料瓶置于室内，分别在0、0.05、0.5、1、2、6、12、24 h时测定其ACC和p H值。无加入甘油的SAEW作为对照。

1.3 体外杀菌实验

1.3.1 试验菌株

大肠埃希菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）是引发奶牛乳房炎的主要致病菌。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌由内蒙古农业大学兽医学院提供；无乳链球菌（CVCC3940）及停乳链球菌（CVCC3701）菌株从中国兽医微生物菌种保藏管理中心购买。

1.3.2 药浴剂的配置

SAEW-1:ACC：（30±1.2）mg/L，pH:6.30±0.13，下述简称：SAEW（30）。

SAEW-2：ACC：（60.0±1.9）mg/L，p H:6.45±0.24，下述简称：SAEW（60）。

SAEW（60）+3%甘油：加入甘油，充分混合，过2 h后立即做实验。

SAEW（60）+10%甘油：加入甘油，充分混合，过2 h后立即做实验。

0.5 %聚维酮碘：将5%的聚维酮碘（5%聚维酮碘，石家庄市光华药业有限公司生产）用无菌生理盐水稀释至0.5%，作为对照实验。

1.3.3 杀菌实验

1.3.3.1 细菌培养

取出冰柜冻存的待试验菌株，分别接种于相应培养基中，置于恒温箱37℃培养48 h；其中大肠埃希和金黄色葡萄球菌接种于牛肉蛋白胨培养基，停乳链球菌和无乳链球菌接种于THB培养基；取出培养物，选取典型菌落转种3代备用。保证菌液的浓度在1×106～6×106cfu/mL。

1.3.3.2 对奶牛乳房炎致病菌的消毒效果实验

在无菌操作常温条件下，将制备的0.1 mL菌悬液加入装有0.9 mL的SAEW（30）、SAEW（60）、SAEW（60）+3%甘油、SAEW（60）+10%甘油、0.5%聚维酮碘中，充分混合振荡，处理不同时间5 s、15 s后，吸取9 mL灭菌的中和剂（0.5%的硫代硫酸钠）加入到试管中，混匀，作用10 min，进行10倍稀释，用于培养计数。同时用生理盐水代替药浴剂，进行平行试验，作为阳性对照。

将每个平板均分成4个区域，编号，每个区域滴三滴样液，每滴10μL。重复三次（4DP法）。所有平板均在37℃恒温箱中培养，48 h后观察结果。试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/mL）。其杀菌率由以下公式计算：

2 结果

2.1 甘油对SAEW的ACC和p H的影响

如图1所示，加入甘油的SAEW随着存放时间的延长，其ACC含量逐渐降低。放置2 h后，加入3%甘油的SAEW的ACC由59.80 mg/L降到34.27 mg/L，损失43%；加入10%甘油的SAEW的ACC由59.80 mg/L降到25.64 mg/L，损失57%；放置24 h后加入不同浓度甘油的SAEW的ACC损失达到90%。在6 h以内高浓度甘油对SAEW的ACC影响明显高于低浓度甘油，甘油浓度对ACC的影响较大。

图1 甘油对SAEW的ACC的影响

如图2所示，SAEW里加入不同浓度的甘油后，随着存放时间的延长其p H值明显下降，但2 h之内下降速度较缓慢，保持在p H 5.5以上。2 h到6 h之间，其pH值下降速度较快，24 h后基本达到3.5。另外，甘油浓度对pH的影响不明显。

图2 甘油对SAEW的pH值的影响

2.2 体外杀菌实验

试验结果如表1所示，ACC为30 mg/L的SAEW、ACC为60 mg/L的SAEW、ACC为60 mg/L+3%的甘油、ACC为60 mg/L的SAEW+10%甘油的不同奶牛乳头药浴剂在反应时间5 s内，对奶牛乳房炎主要致病菌的杀菌率均大于81%，杀菌时间15s内杀菌率均超过88%；这四种药浴剂的杀菌效果与常用乳头药浴剂0.5%的聚维酮碘的杀菌效果比较，发现除了SAEW（30）的个别杀菌率低于聚维酮碘外，其它实验组基本上达到或超过对照组聚维酮碘的效果。SAEW加不同浓度的甘油后其杀菌率均大于96%，0.5%的聚维酮碘的杀菌率也超过93%。

表1 SAEW、SAEW+甘油、聚维酮碘对奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果比较（n=3） %

3 讨 论

目前，奶牛场常用消毒液有碘伏、次氯酸钠和新洁尔灭等[15]，均需用水稀释后使用，药浴后蒸发较快，作用持续时间短，易造成乳房的重复感染，且对奶牛皮肤有一定的刺激和影响[16]。其中聚维酮碘是由聚乙烯毗咯烷酮与碘结合形成的一种无定形复合物，对皮肤有比较好的湿润和保护作用，因此广泛应用于奶牛场的乳头消毒。但碘制剂消毒液有一定的残留作用，Bogdan等人发现，碘消毒和乳房乳头药浴将增加平均牛奶碘含量从（44±1.6）～（59.3±2.3）μg/1000 mL[3]。

与其它化学消毒剂相比，SAEW杀菌后可完全还原成无毒、无残留的普通水，排放后对环境无任何污染，对生态环境不会造成危害，而且制作成本低廉，使用简单方便[13]。但单独使用SAEW，药浴后蒸发较快，尤其是冬天可能引起奶牛的干裂和冻裂等缺点。本研究旨在SAEW内加入甘油而研制一种安全、对环境友好、无残留、成本低廉并且能够保护皮肤的新型药浴剂。

实验结果表明，虽然甘油的加入会SAEW的ACC明显下降，但在2 h之内残留ACC仍然能够保持在较高水平。实验在ACC为60 mg/L的SAEW内加入3%和10%的甘油，并2 h后进行杀菌实验，杀菌率基本上达到或超过对照组聚维酮碘的杀菌效果。

考虑到加入甘油后的SAEW的不稳定性，在实际应用中建议使用更高ACC的SAEW，并且现做现用，必须甘油混合后2 h之前进行乳头药浴；根据天气温度适度调节甘油浓度，建议夏天3%，冬天最高可达10%。消毒步骤应分两步进行，挤奶前和挤奶后。挤奶前的清洗和消毒，使用无甘油添加的纯SAEW,该步骤融合了清水冲洗和药浴消毒两个步骤,简化了生产程序,而且对比效果明显[13]。挤奶后药浴使用加入甘油的SAEW，又能消毒也有能保护皮肤。本实验只是室内杀菌效果观察，在实际应用过程中需进一步研究具体的消毒方法，比如冲洗、药浴以及重复浸泡乳头后ACC降解等试验，从而确定具体应用过程中的最佳消毒方案。

4 结论

通过体外杀菌试验证明，在一定条件下，微酸性电解水加入甘油后其消毒效果达到聚维酮碘的同等效果。其意义在于，微酸性电解水与传统碘制剂相比安全、无残留、环保等优点，加入甘油后有一定的保护乳头作用。实验结果对开发一种安全、有效、环保的新型乳头药浴剂提供了理论基础。