不同方法灭活卯黄抗体的比较试验

孙心　梁宛楠　姜宇

摘要：为确保提取卯黄抗体的安全性，防止其中混入外源病毒，为此使用了化学药品灭活的方法。试验对不同终浓度的甲醛和二乙烯亚胺（BEI）对卯黄抗体灭活效果进行了比对。将鸡新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV H9型）、禽传染性囊病病毒（IBDV）、减蛋综合征病毒（EDS-76）和禽脑脊髓炎病毒（AEV）分别混入到卯黄抗体中，混合后加入终浓度为0.03%、0.05%、0.1%甲醛和0.02%BEI于室温条件下，灭活24h，从试验结果我们可以看出0.02%BEI和0.03%甲醛只能灭活部分病毒，而0.05%和0.1%甲醛能灭活全部病毒，并且对抗体活性无任何影响。因此，综合以上结果选用0.05%的甲醛进行灭活，保证疫苗的安全性。

关键词：灭活；卵黄抗体；BEI；甲醛

在制备抗小鹅瘟卯黄抗体时，应选择健康的产蛋母鸡，按一定的免疫程序接种小鹅瘟抗原，获得高免鸡蛋。试验过程中的免疫鸡群，虽然经过一系列的挑选及其它疫病的免疫，但是还是存在某些病毒的感染，对卯黄抗体的安全性有很大的影响。因此本试验选用甲醛和二乙亚胺（BEI）两种灭活剂进行试验。在卯黄抗体中加入甲醛溶液终浓度分别为0.03%、0.05%和0.1%，BEI的终浓度为0.02%，通过试验比对从中选出最适宜的灭活剂浓度。

1材料和方法

1.1材料

病毒：小鹅瘟病毒、禽流感病毒（H9）、鸡新城疫病毒（1株）、禽传染性囊病病毒（B87株）、减蛋公司综合征病毒（EDS-76株）均为研发中心繁殖；禽脑脊髓炎病毒（Van Roekel株）购自中监所。

化学试剂：甲醛溶液（天津，AR）、BEI（瑞士）。

SPF种蛋：哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场；SPF鸭蛋：哈尔滨兽医研究所。

1.2试验方法

1.2.1抗体制备参照制定的工艺规程制备小鹅瘟卯黄抗体。

1.2.2抗体灭活卯黄抗体与AEV、NDV、AIV、EDS-76、IBDV按9：1的比例混合。将上述的混合液各加入3种不同终浓度0.03%、0.05%、0.1%甲醛溶液和终浓度为0.02%BEI。于室温（20～25℃）条件下灭活24h，同时设对照组选用未灭活的病毒与卯黄抗体进行混合。

1.2.3灭活效果检验 1）鸡胚检验：取灭活后的NDV、AIV、IBDV和AEV混合液，接种SPF鸡胚，记录鸡胚死亡情况及病理变化并设立病毒对照组。2）鸭胚检验：取灭活后的EDS-76混合液，接种SPF鸭胚，记录鸭胚死亡情况及病理变化并设立病毒对照组。3）血凝检验：取鸡胚（或鸭胚）死亡胚或存活胚（IBDV除外），吸取胚液，作血凝活性测定。

1.2.4灭活的卯黄抗体检验1）效价的测定：灭活的卯黄抗体按照“小鹅瘟诊断技术”的方法，进行琼脂扩散试验测定抗体效价。2）蛋白含量的测定：灭活的卯黄抗体按照“考马斯亮蓝染色法”进行抗体中蛋白量的测定。3）纯度的测定：以SDS-PAGE电泳检查，分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%，电压120V，考马斯亮蓝R-250染色。

2结果

2.1灭活效果检验

2.1.1鸡胚检验 卵黄抗体与病毒混合后，用终浓度不同的甲醛和BEI进行灭活，由于病毒的增殖位置不同，通过不同的接种途径进行接种，培养观察一定时间，记录鸡胚死亡情况，结果见表1。

2.1.2鸭胚检验 卵黄抗体与EDSV混合后用终浓度不同的甲醛和BEI灭活，通过尿囊腔接种鸭胚，培养观察一定时间，记录鸭胚死亡情况，结果见表2。

2.1.3血凝活性测定结果 灭活后的卯黄抗体通过不同途径接种鸡胚（鸭胚）后，观察鸡胚（鸭胚）死亡情况的同时，收集死胚的尿囊液做红细胞凝集试验，结果见表3。

2.1.4病理变化混有AEV的卯黄抗体灭活后，连同阳性对照，通过卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL，各5只，同时设立阴性对照，培养至18日龄，其中接种后10、11d阳性对照各死亡1只鸡胚，其余均存活。鸡胚进行解剖，观察鸡胚发生的病理变化。观察到阳性对照鸡胚矮小萎缩、脚趾蜷曲、肌肉营养不良等典型的病理变化，而阴性对照及各灭活AEV和卯黄抗体混合液组的鸡胚均发育正常。

2.2灭活后的卵黄抗体检查

2.2.1效价的测定 用终浓度为0.03%、0.05%和0.1%甲醛和终浓度为0.02%的BEI灭活的卯黄抗体进行琼脂扩散效价的测定，结果见表4。

2.2.2蛋白含量的测定 用终浓度为0.03%、0.05%和0.1%甲醛和终浓度为0.02%的BEI灭活的卯黄抗体进行蛋白含量测定，结果见表5。

2.2.3纯度测定结果用终浓度为0.03%、0.05%和0.1%甲醛和终浓度为0.02%的BEI灭活的卯黄抗体作SDS-PAGE电泳分析，检查纯度的变化，结果见图2。

3讨论

为确保卯黄抗体的安全性，不仅要严格选产蛋母鸡，对一些蛋媒性产生传染性的病毒要进行检验外，同时在免疫球蛋白（IgY）提取中进行灭活处理对保证卯黄抗体制品的安全性也是十分重要的环节。本试验提取IgY的工艺流程中，使用辛酸处理，此方法能有效地灭活部分病毒。但是为了让生产出的产品更加的安全可靠，在生产的过程中增加了灭活工艺，选用不同終浓度的甲醛和BEI两种灭活剂进行试验。

通过试验比较两种灭活剂对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、禽传染性囊病病毒、减蛋综合征病毒和禽传染性脑脊髓炎病毒的灭活效果。结果0.02%BEI不能完全灭活鸡新城疫病毒、禽传染性囊病病毒和减蛋综合征病毒。在实验中，0.03%甲醛溶液对禽传染性囊病病毒灭活不彻底，而0.05%和0.1%的甲醛溶液均能彻底灭活这5种病毒，同时含有病毒的卯黄抗体经灭活后，再接种SPF鸡胚（或鸭胚），不引起死亡。另外，灭活上述有血凝性病毒时，接种鸡胚（或鸭胚），收集死胚或活胚的尿囊液，经红细胞凝集试验检查，均呈阴性，证明无病毒在胚内增殖。禽脑脊髓炎病毒的灭活试验可以看出，病毒阳性对照表现出典型的症状，而试验组的胚体都发育正常，可以看出试验的灭活方法均可对卯黄抗体中混有的AEV彻底灭活。

通过试验0.02%BEI和0.03%甲醛溶液不能完全灭活一些病毒，所以不被采用。使用0.05%和0.1%甲醛溶液灭活后，测定灭活卯黄抗体的变化，结果卯黄抗体的琼脂扩散效价不降低，蛋白含量、IgY的纯度均无影响。

试验仅做了5种指示病毒的灭活效果检查，由于条件所限未能进行更多病毒的灭活试验，今后如果能索取到一些相关病毒，将开展进一步的灭活试验。

4结论

终浓度为0.05%和0.1%的甲醛溶液在室温（20～25℃）、灭活24h后，能完全灭活NDV、AIV、IBDV、EDSV和AEV等。

严格选择产蛋母鸡，在卵黄囊制品的提取制备工艺中，经辛酸处理，并加入0.05%甲醛溶液灭活，可以确保产品的安全性。