川陈皮素潜在药效靶标预测及多维药理作用分析

李跃文，朱 斌，刘志强，王博龙



川陈皮素潜在药效靶标预测及多维药理作用分析

李跃文，朱 斌，刘志强，*王博龙

（宜春学院化学与生物工程学院，江西，宜春 336000）

预测中药活性成分川陈皮素的潜在靶标并进行分子对接验证，探讨其多维药理作用。运用反向分子对接服务器PharmMapper将川陈皮素与2241个人类蛋白靶标分别对接，选取Normalized Fit Score打分值前15的靶蛋白，采用Systemsdock Web Site平台对具有疾病治疗价值的主要靶蛋白进行正向分子对接验证。川陈皮素与成纤维细胞激活蛋白（Seprase）、网织红细胞-4受体（Reticulon-4 recoptor)、组织蛋白酶L2（CathepsinL2）3个靶蛋白结合较好，对接分数分别为5.215、5.227、6.090。靶蛋白药效团模型与川陈皮素分子特征一致，分子对接显示川陈皮素与靶蛋白核心氨基酸有相互作用。川陈皮素与Seprase、Reticulon-4 recoptor、CathepsinL2 3个重要靶蛋白结合强度较好，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等药理作用。

川陈皮素；反向分子对接；药效团模型；靶蛋白

中药活性成分的潜在生物靶标预测是一项艰难的任务，为改进实验方法提高工作效率，科学家提出了一系列经典的方案，比如分子对接（reverse docking）。分子对接来源于1894年德国化学家Fisher提出的“锁-匙（Lock and Key Theory）”学说，就是把来源自三维数据库的配体分子放置到受体大分子的活性位点中，预测配体分子跟受体结合构象及作用能的过程。分子对接包括反向分子对接和正向分子对接。反向分子对接是用小分子化合物包括天然产物、先导化合物或化学合成物为探针，在已知结构的靶点三维数据库里寻找能够和它结合的生物大分子，通过空间与能量匹配互相识别形成靶标-配体分子复合物，在此程度上去预测小分子天然产物、先导化合物或化学合成物的潜在靶点[1-2]。正向分子对接则是运用大批的小分子活性化合物跟靶标蛋白的结构进行对接，筛选出能够与靶标蛋白相结合的活性化合物[3]。在INVDOCK、TarFisDock和PharmMapper等计算机工具为用户所熟知并得到应用之后，反向分子对接便捷的预测能力为发现潜在药物靶点提供了帮助，现如今已经变成靶点识别中无法代替的技术工具。

PharmMapper在线服务器是根据“反向”药效团映射方法对中药活性小分子进行潜在药物靶标预测[4]。目前常用的正向分子对接软件有Dock、AutoDock Vina、Molegro Virtual Docker、iGemdock以及Systemsdock Web Site服务器等。Systems dock Web Site是一个基于网络药理学预测和分析的网络服务器，它应用高精度对接模拟和分子通路图，全面表征配体选择性，并说明配体如何作用于复杂的分子网络。它具有Dock-IN评分的分子对接功能，用以评估蛋白质-配体结合潜力。陈宇综[5]等人使用INVDOCK查找大黄中大黄素的靶点，事实证明大黄素的作用潜在靶点是基质金属蛋白酶，这个预测继而得到抗肿瘤分子生物学实验这一验证。陈少军[6]等利用反向分子对接成功预测出醛糖还原酶可能是丹参醇A的潜在靶蛋白之一。

川陈皮素（nobiletin）是从芸香科柑桔属橘子果皮和茎中提取的一种多甲氧基黄酮类化合物，现代药理学研究[7-9]证实其具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等多种药理作用。白洁等[10]基于分子对接发现川陈皮素与P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的 Phe974形成较强的Pi-Pi键，并通过细胞双向转运实验研究发现川陈皮素具有较强的P-gp抑制作用，并从细胞和整体动物水平探讨川陈皮素对P-gp调控的生物学效应。因此，预测和筛选中药活性成分川陈皮素的潜在分子靶标是一项重要且有意义的工作。

本研究利用PharmMapper服务器对川陈皮素的潜在靶标进行虚拟筛选，得到一连串匹配效果不一样的蛋白靶标。对匹配后得分较高的蛋白靶标，采用Systemsdock Web Site服务器进行正向分子对接验证。从反向和正向分子对接两个方面进行潜在靶点探索，以期为川陈皮素的潜在药物靶标的发现提供理论指导和科学实验依据。

1 材料与方法

中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP、反向分子对接服务器Pharm Mapper、正向分子对接服务器Systemsdock Web Site。

1.1 配体准备

首先利用TCMSP数据库确定川陈皮素的化学结构。在ChemBioDraw Ultra 14.0程序中绘制配体分子的结构，使用菜单Caculations中力场MMFF94对其进行能量最小化，使得手工画上去的那部分的键长和键角标准化，从而获得稳定的化合物结构。最后将文件保存为mol格式文件。

1.2 川陈皮素潜在靶标预测

将川陈皮素的mol格式文件上传至PharmMapper服务器，利用反向对接服务器PharmMappe对川陈皮素进行模拟分子-靶蛋白对接，靶点范围设置“Human Protein Targets Only（v2010，2241）”，其余参数保持默认设置。PharmMapper服务器自动对配体小分子与其数据库中的药效团模型匹配，按照匹配的得分高低排序。

1.3 正向分子对接验证

为了进一步验证筛选出的蛋白靶标，采用systems dock Web Site 软件，将川陈皮素作为配体与得分靠前且具有疾病治疗价值的3个靶蛋白分别进行正向分子对接验证。正向分子对接过程中由 Docking Score分值表示对接结果，打分越高说明药物与蛋白靶标的结合越好[11]。药效团匹配是基于氢键供受体、正负电荷中心、芳环中心、疏水基团、亲水基团等药效特征元素对分子构效关系进行评价。而分子对接侧重从静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华力作用预测两者间的结合模式和亲和力等药效特征元素对分子构效关系进行评价。

2 结果

2.1 川陈皮素结构

川陈皮素的2D及3D结构如图1和图2所示。

图1 川陈皮素的2D结构

图2 川陈皮素的3D结构

2.2 川陈皮素潜在靶标虚拟筛选

为了筛选配体小分子的潜在靶点，采用PharmMapper在线平台上把小分子和数据库中靶标蛋白的药效团模型进行匹配，根据Normalized Fit Score打分值对川陈皮素的潜在靶标进行筛选，得到打分值前15的靶蛋白，如表1所示。

表1 Normalized Fit Score打分值前15的靶蛋白

注：-代表PharmMapper服务器中筛选的靶蛋白没有对应的疾病

2.3 川陈皮素潜在药效靶标的正向分子对接验证

使用Systemsdock Web Site服务器，将川陈皮素作为配体与筛选得到的成纤维细胞激活蛋白（Seprase）、网织红细胞-4受体（Reticulon-4recoptor)、组织蛋白酶L2（CathepsinL2）靶蛋白分别进行正向对接验证。如表2为川陈皮素与三种靶标蛋白药效团匹配特征，川陈皮素与成纤维细胞激活蛋白（Seprase）的药效团模型中没有疏水特征，有2个氢键受体1个氢键供体；与网织红细胞-4受体（Reticulon-4recoptor）的药效团模型中有没有疏水特征，有2个氢键受体1个氢键供体；与组织蛋白酶（CathepsinL2）的药效团模型中有1个疏水特征，有1氢键受体1个氢键供体。

表2 川陈皮素与靶标蛋白药效团匹配特征

2.3.1 川陈皮素与成纤维细胞激活蛋白（Seprase）的分子对接

图3为川陈皮素与成纤维细胞激活蛋白的对接模型。成纤维细胞激活蛋白结合的氨基酸残基Asn92（B）形成疏水相互作用，同时Asn92（B）和Asn74（B）与川陈皮素形成氢键相互作用，川陈皮素与成纤维细胞激活蛋白活性位点存在氢键作用和疏水作用。图4为原配体与成纤维细胞激活蛋白的对接模型。

图3 川皮素与成纤维细胞激活蛋白的分子对接模型（a）3D图、（b）平面图

图4 原配体与成纤维细胞激活蛋白的分子对接模型(c)3D图、（d)平面图

2.3.2 川陈皮素与网织红细胞-4受体（Reticulon-4recoptor）的分子对接

图5为川陈皮素与网织红细胞-4受体的分子对接模型图。网织红细胞-4受体结合蛋白的氨基酸残基His2163（B）、Gys2025（B）、Phe2069（B）、Asp2162（B）和Gly2023（B）形成疏水相互作用，同时Phe2069（B）、Gln2019（B）和Trp2189（B）与川陈皮素形成氢键相互作用，川皮素与网织红细胞-4受体活性位点存在氢键作用和疏水作用。图6为原配体与网织红细胞-4受体的对接模型。

图5 川陈皮素与网织红细胞-4受体的分子对接模型（a）3D图、（b）平面图

图6 原配体与网织红细胞-4受体的分子对接模型（c）3D图、（d）平面图

2.3.3 川陈皮素与组织蛋白酶L2（CathepsinL2）的分子对接

图7为川陈皮素与组织蛋白酶的分子对接模型。组织蛋白酶结合蛋白的氨基酸残基Ala154（A）和Ala155（A）形成疏水相互作用，同时Ala154（A）、Ala155（A）和Asn179（A）与川陈皮素形成氢键相互作用，川陈皮素与组织蛋白酶活性位点存在氢键作用和疏水作用。原配体与组织蛋白酶受体的对接模型如图8所示。

图7 川陈皮素与组织蛋白酶L2的分子对接模型（a）3D图、（b）平面图

图8 原配体与组织蛋白酶的分子对接模型（c）3D图、（d）平面图

如图9所示，中药活性成分川陈皮素与成纤维细胞（Seprase）、网织红细胞-4受体（Reticulon-4recoptor）、组织蛋白酶L2（CathepsinL2）3个药效靶标蛋白对接分数分别为5.215、5.227、6.090。一般来说，打分的高低决定着分子与靶点的结合活性，docking score值大于4.25说明分子与靶点有一定的结合活性，大于5.0说明分子与靶点有较好的结合活性，而大于7.0则说明分子与靶点具有很强烈的结合活性。

图9 川陈皮素与三个靶标蛋白对接分值

3 讨论

在本研究中基于川陈皮素与PharmMapper中2241个人类蛋白靶标反向对接结果，选取Normalized Fit Score打分值前15的靶蛋白，采用Systemsdock Web Site平台对具有疾病治疗价值的靶标蛋白进行正向分子对接验证实验，发现川陈皮素与成纤维细胞激活蛋白（Seprase）、网织红细胞-4受体（Reticulon-4recoptor）、组织蛋白酶L2（CathepsinL2）3个重要靶蛋白结合强度较好，Docking Score依次为6.090、5.227、5.215。Seprase是丝氨酸蛋白酶（SIMP）家族的典型代表，人类Seprase最初作为一种糖蛋白肽酶首先在侵袭性恶性黑色素瘤细胞中被鉴定出来，有选择性在浸润前沿的恶性黑色素瘤细胞和乳腺癌细胞表面的突出部位表达[12]。也有研究[13]表明Seprase主要在炎症、创伤、上皮性癌及其基质中被激活的成纤维细胞中表达，成熟的体细胞不表达。现已在瘢痕瘤和胰腺癌等多种肿瘤组织发现Seprase蛋白的高表达，以Seprase作为上皮性肿瘤免疫检测和免疫治疗的靶点正在研究中[14-15]。

网织红细胞是介于晚幼红细胞与成熟红细胞之间尚未完全成熟的红细胞，是红细胞成熟过程的一个重要阶段。郑扣龙等[16]研究发现网织红细胞绝对数增高可作为急性心肌梗死住院患者病死率增加的预测因子。恶性肿瘤患者在化疗开始后，网织红细胞绝对数与白细胞计数均下降，未成熟网织红细胞指数的动态变化可作为早期评价肿瘤患者放、化疗后骨髓抑制和恢复的较敏感指标[17-18]。组织蛋白酶作为一种溶酶体蛋白酶可参与多种重要生理活动，如蛋白质水解、抗原提呈、T细胞分选、细胞凋亡、以及胚胎发育等。有研究[19-22]发现组织蛋白酶能够通过蛋白水解作用降解细胞外基质，催化降解基质膜，从而为肿瘤细胞穿透细胞外基质的移行和转移创造条件，促进肿瘤细胞生长空间的扩展、肿瘤血管的生成等。研究[23-25]表明大量组织蛋白酶 L释放到胞质或组织间隙，并被激活，降解细胞成分或细胞间质基质组分，参与肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、动脉粥样硬化等慢性炎症性疾病的发生发展过程。

苏明媛等[26]研究发现川陈皮素可提高凋亡蛋白酶caspase-3的活性，诱导HeLa细胞发生凋亡，显著抑制Caco-2、HeLa、Hep G2、A375等 5种肿瘤细胞的生长与增殖。在人角质形成细胞中，川陈皮素可作为过氧化酶体增殖物激活型受体激动剂，通过抑制COX-2的表达以及降低胞浆中磷脂酶A2的活性来减少UVB诱导所产生的前列腺素E[27]。宫先卫研究[28]发现川陈皮素可提高细胞清除活性氧能力以及促进NO分泌，对体外高糖诱导的内皮细胞损伤具有保护作用。张艳艳等[29]研究发现对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀都有明显的抑制作用，具有良好的抗炎作用。

综上所述，本研究预测出的川陈皮素的主要疾病靶蛋白与川陈皮素抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等药理作用相吻合，表明通过反向药效团匹配和分子对接方法可以预测川陈皮素潜在靶点的准确性。

[1] 关宏炜,徐丽君,董慧. 反向分子对接技术在中药作用靶点预测、有效成分筛选及作用机制探索中的应用[J].中国中药杂志,2017,42(23): 4537-4541.

[2] 刘志强,王博龙. 基于TCMSP抗肿瘤中药小分子EGFR-TKI的研究[J].井冈山大学学报:自然科学版, 2018,39(2):87-92.

[3] 段爱霞,陈晶,刘宏德,等. 分子对接方法的应用与发展[J].分析科学学报,2009,25(4):473-477.

[4] 吴纯伟,路丽,梁生旺,等. 药物靶标预测技术在中药网络药理学中的应用[J].中国中药杂志,2016,41(3):377- 382.

[5] 陈宇综,Ung Chong Yung. 计算机辅助药物靶标搜寻在探索中草药有效成分机制方面的应用[J].中国药物化学杂志,2001(3):145-148.

[6] 陈少军,陈宏降,郭章华.反向分子对接法预测丹参醇A的潜在靶点[J].中药药理与临床,2014,30(5):58-61.

[7] Xu L L, He Y Q, Guo X, et al.Identification of metabolites of nobiletin in rats using ultra-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole mass spectrometry [J]. Acta Pharm Sin,2011,46(12): 1483-1487.

[8] Karen L, Morley, Peter J, et al. Tangeretin and nobiletininduce G1 cell cycle arrest but not apoptosis in human breast andcolon cancer cells[J]. Cancer Letters，2007,251(1):168-178.

[9] Yao X L, Zhu X R, Pan S Y,et al. Antimicrobial activity ofnobiletin and tangeretin against Pseudomonas[J]. Food Chemistry,2012,132(4):1883- 1890.

[10] 白洁,赵晟宇,范小庆,等. 川陈皮素对P-糖蛋白的体内外抑制作用及分子机制研究[J].药学学报,2018,53(5): 1-6.

[11] Hsin K Y, Matsuoka Y, Asai Y, et al. SystemsDock：A web server for network pharmacology-based prediction and analysis[J].Nucleic Acids Res,2016,44(W1):507- 513.

[12] Pineiro-Sanchez M, Goldstein L A, Dodt J, et al. Identification of the 170 kDa melanoma membrane- bound gelatinase(seprase) as a serine integral membrane protease[J].J Biol Chem,1997,272(12):7595- 7601.

[13] 张梦真,乔玉环,索振河. 卵巢上皮性癌组织Seprase蛋白表达及其预后意义的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2010，17(4):285-289.

[14] O'Brien P, O'Connor B F. Seprase: an overview of an important ma-trix serine protease[J]. Biochim Biophys Acta,2008,1784(9):1130-1145.

[15] 苑文娜,张梦真. DPPⅣ蛋白和Seprase蛋白在卵巢上皮性癌中的表达及意义[J].实用妇产科杂志,2012,28(1): 57-59.

[16] 郑扣龙,张清. 急性心肌梗死患者外周血网织红细胞绝对值的相关研究[J].黑龙江医药,2010,16(23):924-925.

[17] 郭学松,王潮,蔡姝. 网织红细胞成熟指数在恶性肿瘤化疗前后动态变化的临床意义[J].现代医药卫生,2011, 27(10):1497-1498.

[18] 董磊,吉品健,马红雨,等. 网织红细胞的研究进展及应用[J].医学综述,2012,18(16)：2567-2569.

[19] Sun J, Sukhova G K, Zhang J, et al. Cathepsin L activity isessential to elastase perfusion-induced abdominal aorticaneurysms in mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31 (11)：2500-2508.

[20] Miyamoto K, Iwadate M, Yanagisawa Y, et al. Cathepsin L ishighly expressed in gastrointestinal stromal tumors[J]. Int JOncol,2011,39 (5):1109-1115.

[21] Skrzypczak M, Springwald A, Lattrich C, et al. Expression ofcysteine protease cathepsin L is increased in endometrial cancerand correlates with expression of growth regulatory genes[J].Cancer Invest,2012,30 (5)：398-403.

[22] 刘学政,周亮,黄岗宜. 胶质瘤Hsp70-肽复合物激活T淋巴细胞抗肿瘤研究[J].井冈山大学学报:自然科学版, 2010,31(2):75-77.

[23] Friedrich C. Luft. From furless to heartless-unraveling thediverse functions of Cathepsin L[J].J Mol Med,2009,87(3):225-227．

[24] 曹新广,郭长青,李继昌,等. 原位杂交检测组织蛋白酶L在大肠癌中的表达[J].肿瘤基础与临床,2007,16(1): 9-11.

[25] Sullivan S,Tosetto M, Kevsns P, et al. Localization of nu-clear cathepsin L and association with disease progressionand poor outcome in colorectal cancer[J]. Int J Cancer,2009,125(1):54-61.

[26] 苏明媛,牛江龙,李林,等. 川陈皮素的体外抑癌活性及其机制研究[J].中成药,2011,33(9):1479-1483.

[27] 杨笛,蒋献. 川陈皮素治疗皮肤疾病的研究进展[J].华西药学杂志,2016,31(1):107-108.

[28] 宫先卫. 川陈皮素对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用[D].济南:山东大学,2011.

[29] 张艳艳,卢艳花. 陈皮黄酮川陈皮素的分离纯化及抗炎止血作用研究[J].辽宁中医杂志,2014,41(6):1238-1239.

PREDICTION OF POTENTIAL PHARMACODYNAMICS TARGET OF NOBILETIN AND ANALYSIS OF ITS MULTI-DIMENSIONAL PHARMACOLOGICAL ACTION

LI Yue-wen，Zhu Bin，LIU Zhi-qiang，*WANG Bo-long

(School of Chemical and Biological Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000, China)

To predict and carry molecular docking verification of the potential target of the active product of traditional Chinese medicine nobiletin, to explore its multidimensional pharmacological effects.The reverse molecular docking server PharmMapper was used to dock nobiletin and 2241 human protein targets respectively, then the top 15 target proteins in Normalized Fit Score evaluation were selected to perform positive molecular docking verification by using Systemsdock Web Site platform.Nobiletin combined well with 3 target proteins as Seprase, Reticulon-4 recoptor, and CathepsinL2 with the docking scores of 5.215, 5.227, and 6.090 respectively. The target protein pharmacophore model was consistent with the molecular characteristics of nobiletin. Molecular docking showed that there was interaction between nobiletin and the target protein core amino acids.Nobiletin has good binding strength with three important target proteins as Seprase, Reticulon-4 recoptor, CathepsinL2, and has anti-cancer, anti-oxidation, anti-inflammatory, anti-thrombosis and other pharmacological effects.

nobiletin; reverse molecular docking; pharmacophore model; target protein

1674-8085(2018)05-0073-08

R965.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.05.015

2018-06-19；

2018-08-31

江西省“2011协同创新中心”（天然药物活性成分研发与应用）；江西省教育厅科技计划项目（GJJ12596）

李跃文(1993-)，男，河南南阳人，硕士生，主要从事临床药学研究(E-mail:1297513234@ qq.com);

朱 斌(1996-)，男，江西吉安人，宜春学院化学与生物工程学院药学专业2014级本科生(E-mail:649365048@qq.com);

刘志强(1993-)，男，河南鹤壁人，硕士生，主要从事临床药学研究(E-mail:626814166@ qq.com);

*王博龙(1977-)，男，陕西扶风人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事药物临床前研究及临床有效性与安全性评价研究(E-mail:wblong77@126.com).