白皮杉醇对早期糖尿病肾病大鼠肾脏的影响研究*

吴荣艳 刘德慧 何勇 谭菲 王丽芳 刘宏明 何燕琴

糖尿病肾病（DN）是临床上常见的糖尿病并发症之一，随着该病的发病率逐年上升，已经严重危害到人类的健康[1-2]。该病早期无明显症状，患者可以无任何不适症状，但当发展到终末期肾脏病时，由于其存在复杂的代谢紊乱，因此往往会比其他的肾脏疾病更难以治疗，最终导致患者死亡[3-5]。糖尿病肾病初期病理表现为肾小球高滤过和肾脏肥大，基底膜（GBM）增厚，系膜区基质增多，随后肾脏出现肾小球结节样病变与小动脉玻璃样变，最终发展为终末期肾衰竭[6-7]。其主要特征为肾小球高滤过、高灌注状态以及出现滤过屏障障碍[8]。白皮杉醇是白藜芦醇的羟基化类似物，是一种在葡萄、甘蔗等植物中发现的多酚化合物[9]。据相关研究报道，白皮杉醇有抗氧化、清除氧自由基的作用，因而能够抗衰老、抗菌抗炎并且提高机体的免疫调节力[10-11]，亦有国外学者发现，白藜芦醇及其类构物能够改善被脂多糖影响的肾血流动力学指标，其作用机制为下调血浆与尿液中NO的含量，从而抵抗脂多糖导致的肾脏损伤[12]。本研究通过建立糖尿病肾病大鼠模型，拟探讨白皮杉醇对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康Wistar大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）50只，雌雄各半，适应性喂养1周，饲养于恒温恒湿环境中，正常进食饮水。

1.2 实验试剂 链脲佐菌素（美国Sigma公司）；白皮杉醇（杭州唯铂莱生物科技有限公司）；肌酐测试盒与尿素氮测试盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.3 动物分组 按照随机数字表法将大鼠分为五组，正常对照组（A组）、模型组（B组）、白皮杉醇低剂量组（C组）、中剂量组（D组）和高剂量组（E组），各10只。

1.4 模型建立及给药 适应性喂养后，正常对照组大鼠给予普通饲料进行喂养；其余各组给予高脂高糖饲料喂养1周，禁食12 h后采用无菌枸橼酸钠缓冲液配置的42 mg/kg链脲佐菌素（STZ）进行腹腔注射，72 h后取尾静脉血进行血糖检测，以血糖值≥16.7 mmol/L时为造模成功。造模成功后，对白皮杉醇低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠分别采用20、40、60 mg/kg白皮杉醇进行灌胃，1次/d，共给药4周。模型组与正常对照组给予等量生理盐水，其余同上。

1.5 样本收集 上述步骤完成后，各组大鼠禁食不禁水24 h，置于代谢笼中收集尿液，离心备用；之后对大鼠进行腹腔注射麻醉，穿刺腹主动脉，将采集到的血液置于抗凝真空采血管中，静置1 h后于3 000 r/min离心机中离心10 min，取上清液备用；穿刺取血后，摘取大鼠双侧肾脏，清洗后右侧肾脏切取皮髓交界处组织备用，左侧肾脏使用4%多聚甲醛固定备用。

1.6 观察指标 以大鼠的空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）与肌酐（Scr）、尿微量白蛋白（U-mAlb）含量作为观察指标。FGB含量采用血糖仪检测；BUN与Scr含量分别采用脲酶-谷氨酸脱氢酶法与肌苷酸氧化酶法检测；U-mAlb含量采用免疫透射比浊法检测。

1.7 HE染色病理学观察 制作肾脏组织石蜡切片，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中浸泡20 min、梯度乙醇中浸泡5 min，蒸馏水冲洗后再置于苏木素染液中浸泡2 min，水洗，1%盐酸乙醇分化20 s，水洗，用0.5%伊红液染色1 min，最后置于梯度乙醇中进行脱水、二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中透明。中性树胶封固后，于显微镜下观察。

1.8 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x-±s）表示，对计量资料进行分析，单因素方差分析采用one-way ANOVA，组间比较采用Benferroni校正。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的FBG、血清BUN及Scr含量变化比较 A组正常饮食，精神状态正常；B组出现多饮、多食、多尿的症状，体重减轻且精神状态萎靡，FBG、血清BUN含量均明显高于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。C、D和E组经过药物干预后，虽“三多”症状有所缓解，FBG、血清BUN含量均明显低于B组，但均明显高于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各组间血清Scr含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠的FBG、BUN及Scr含量变化比较（x-±s）

2.2 各组大鼠的U-mAlb含量变化比较 经检测，A组的U-mAlb含量为（1.12±0.09）mg/h，B组为（4.05±0.24）mg/h，C 组为（3.67±0.19）mg/h，D 组为（3.23±0.21）mg/h，E 组 为（2.51±0.18）mg/h。B组的U-mAlb含量明显高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C、D、E组的U-mAlb含量均明显低于B组，但均明显高于A组，且其含量随药物剂量的增加而逐渐下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。各组间的U-mAlb含量比较，差异均有统计学意义（F=37.462，P＜0.05）。

2.3 各组大鼠的肾脏病理学观察 A组肾脏未出现明显的病理学变化（图1）；B组肾小管上皮细胞呈空泡样变性，且出现系膜细胞与基质增生（图2）；C、D和E组大鼠肾脏病理学变化明显减轻，其中E组肾脏病理学形态与A组最为接近（图 3～5）。

图1 A组大鼠的肾脏病理学观察（HE，×200）

图2 B组大鼠的肾脏病理学观察（HE， ×200）

图3 C组大鼠的肾脏病理学观察（HE，×200）

图4 D组大鼠的肾脏病理学观察（HE，×200）

图5 E组大鼠的肾脏病理学观察（HE，×200）

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者最重要的合并症之一，也是引起终末期肾脏病的第二位原因[13]。目前，糖尿病肾病的病因以及发病机制仍不明确，但多认为是由各种危险因素与一定遗传背景共同作用而导致疾病发生[14-16]。一般情况下，血液中的肌酐不会被肾小管重吸收，所以几乎全部会随尿液排出体外，据相关研究显示，肾小球滤过率在早期糖尿病肾病患者中无明显变化，其体内血肌酐含量不会有显著变化[17-18]；尿素氮虽能在一定程度上反应肾小球的滤过能力，但容易受到诸如蛋白代谢紊乱、消化道出血等肾外因素影响使得指标发生变化[19]。因此，对血肌酐含量进行检测能更好地反映早期糖尿病肾病患者的肾脏功能的变化情况。本研究显示，给药后，糖尿病肾病大鼠的血肌酐含量虽有略微下降，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；此外，糖尿病肾病大鼠在给药后血清尿素氮含量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），这表明白皮杉醇可能对糖尿病肾病早期的蛋白代谢紊乱症状有一定改善作用。作为肾脏早期损伤的重要标志之一，尿微量蛋白水平能较好地反映出肾小球的损伤情况[20-22]。本次研究显示，给药后糖尿病肾病大鼠尿微量蛋白水平显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，可以推断白皮杉醇对肾脏可能有一定的保护作用。