小檗碱通过Toll样受体减轻高脂诱导的大鼠肾损害

吴跃跃， 黄新梅， 陈灶萍， 徐 炯， 盛 励， 刘 军

复旦大学附属上海市第五人民医院内分泌代谢科，上海 200240

糖尿病已经成为我国慢性肾病首要诱因[1]，给我国慢病防治提出了巨大挑战。以往研究[2-3]报道，Toll样受体(TLR)与肾损害相关。本课题组前期研究[4]显示，小檗碱能通过改善胰岛素抵抗及增加脂联素水平来减轻高脂喂养大鼠的肾损害。然而，小檗碱的肾脏保护作用与TLR的关系目前鲜见报道。因此，本研究用小檗碱干预高脂喂养大鼠，观察肾脏损害情况及相关的分子代谢指标的改变，以期探讨小檗碱改善高脂诱导肾脏损害与TLR的关系。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组 50只8周龄清洁级雄性Wistar大鼠购自中国科学院实验动物中心。大鼠体质量(220±20)g，自由进食、进水，环境温度为(25±1)℃，昼夜周期为12/12 h。适应性喂养1周后，将其随机分为：正常喂养组(NF组)、正常喂养小檗碱组(NF+LBBR组)、高脂喂养安慰剂组(HF组)、高脂喂养低剂量小檗碱组(HF+LBBR组)和高脂喂养高剂量小檗碱组(HF+HBBR组)，每组各30只。该研究通过复旦大学实验动物科学部动物福利和伦理小组审查(20160878A019)。

1.2 喂养方法 正常喂养组给予正常标准饲料，高脂喂养组给予高脂饲料(脂肪供能45%)；饲料均由上海斯莱克实验动物有限责任公司饲料部提供。每天记录体质量和进食量，共喂养8周。喂养4周后， NF+LBBR组、HF+LBBR组及HF+HBBR组分别予低浓度小檗碱(150 mg·kg-1·d-1)、低浓度小檗碱(150 mg·kg-1·d-1)及高浓度小檗碱(380 mg·kg-1·d-1)灌胃4周；小檗碱以0.5%羧甲基纤维素钠[生工生物工程(上海)股份有限公司]配至所须浓度。HF组予0.5%羧甲基纤维素钠干预4周。

1.3 生化指标的测定 喂养8周时，在代谢笼中收集大鼠尿液，测定尿微量白蛋白(MAU)及肌酐(Cr)。尿MAU及Cr测定采用相应大鼠ELISA试剂盒(美国GTX公司)，计算两者比值(ACR)。

干预结束时，麻醉解剖，主动脉采血，取肾脏组织。空腹血糖(GLU)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)等指标在全自动生化分析仪 (Hitachi Boehringer Mannheim, 德国)上测定。空腹血清胰岛素(FINS)ELISA试剂盒购自美国Crystal Chem公司。血清游离脂肪酸(FFA)采用的非酯化脂肪酸C检验法试剂盒购自日本Wako Pure Chemical公司。大鼠白细胞介素-1(IL-1)ELISA试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。大鼠白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)采用的ELISA试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司。

1.4 组织病理检查 肾脏组织取材后置于甲醛中固定48 h，石蜡包埋，按8 μm厚度切片。Masson染色：肾脏组织切片脱蜡、水化，加入Bouin处理液过夜，用自来水冲洗；分别予苏木精染色液及碱性品红染色5～10 min，再予磷钨酸溶液反应5～10 min，最后予苯胺蓝染色。染色后在显微镜下(200倍)观察肾组织病理改变。

1.5 Western印迹测定炎性因子的表达 肾脏组织匀浆后上样20 uL，80 V电泳 30 min后再120 V电泳100 min；100 V转膜2 h后，丽春红染色5～10 min；5%脱脂奶粉室温下封闭1 h；加入按推荐的稀释比配制的TLR2、TLR4、核转录因子-κB(NF-κB)、转化生长因子-β(TGF-β)的相应一抗，室温下孵育2 h；洗膜后，加入按1∶5 000配制的二抗，室温孵育1 h。ECL显影曝光后，分析条带。

2 结 果

2.1 大鼠体质量变化 结果(图1)表明：第3周时，高脂饮食组大鼠的体质量大于正常饮食组(P<0.05)；第5周时，HF组及HF+LBBR组大鼠的体质量明显大于其余3组(P<0.05)；第6周开始，HF组大鼠的体质量大于其余4组(P<0.05)。

图1 大鼠体质量变化m/g

*P<0.05为HF组与NF组相比；△P<0.5为HF+LBBR组与NF组相比；▲P<0.05为HF+HBBR组与NF组相比

2.2 糖脂代谢情况 结果(表1)表明：HF组大鼠

GLU、FINS、FFA水平较NF组升高(P<0.05)。HF+LBBR组和HF+HBBR组GLU、FINS、FFA较HF组明显下降(P<0.05)；高脂喂养时，随着小檗碱剂量增加，FINS水平进一步下降(P<0.05)。

2.3 肾功能变化 结果(表1)表明：HF组及HF+LBBR组MUC、ACR水平均明显高于NF组(P<0.05)；HF+HBBR组MUC、ACR水平低于HF+LBBR组(P<0.05)。 各组SCr、BUN水平差异无统计学意义。 Masson染色结果(图2)表明：高脂喂养时，随着小檗碱剂量增加，肾小球基底膜的厚度变薄，肾小球区域的蓝色沉淀物减少。

表1 大鼠尿蛋白、糖脂代谢及炎症因子情况

MAU：尿微量白蛋白；Cr:肌酐； ACR：尿白蛋白/肌酐；SCr：血肌酐；BUN：尿素氮；GLU:空腹血糖；FINS:空腹胰岛素；IL-1：白介素-1；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白介素-6.*P<0.05与NF组相比；△P<0.05与HF组相比；▲P<0.05与HF+LBBR组相比

图2 肾脏组织Masson染色

2.4 炎症因子变化 结果(表1)表明：HF组大鼠IL-1、TNF-α、IL-6水平均较NF水平升高(P<0.05)。HF+LBBR组和HF+HBBR组大鼠IL-1、TNF-α、IL-6的水平较HF组明显降低(P<0.05)。

2.5 ACR影响因素分析 Pearson分析结果(表2)表明：ACR与GLU、FINS、FFA、IL-1、TNF-α、IL-6正相关(P<0.05)。以ACR为因变量，GLU、FINS、FFA、IL-1、TNF-α、IL-6为自变量，进行logistic多元逐步回归分析，结果显示：IL-6与ACR独立正相关[OR=1.18，95%CI 1.03～1.35，P=0.014]。

表2 ACR影响因素的Pearson相关分析

GLU：空腹血糖；FINS：空腹胰岛素；FFA：游离脂肪酸；IL-1：白介素-1；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白介素-6

2.6 肾脏组织TLR4、TLR2、NF-κB、TGF-β的表达水平 结果(图3)显示：HF组大鼠肾脏组织TLR4、TLR2表达较NF组减少(P<0.05)；高脂喂养时，小檗碱干预后，大鼠肾脏组织TLR4、TLR2表达增加(P<0.05)。HF组大鼠肾脏组织NF-κB、TGF-β表达较NF组增加(P<0.05)；高脂喂养时，小檗碱干预后，NF-κB、TGF-β表达减少(P<0.05)。

图3 高脂喂养与小檗碱对大鼠肾脏组织TLR2、TLR4、NF-κB、TGF-β的表达的影响

3 讨 论

肾脏脂毒性与糖尿病肾病密切相关。糖尿病患者及糖尿病动物模型的肾脏脂质合成代谢增加、脂质分解代谢抑制，导致脂质堆积，进而引起炎症反应，损伤肾脏细胞[5-7]。研究肾脏脂毒性对于糖尿病肾病的早期防治具有重要意义。研究[8]提示，肥胖相关肾损害除肾小球肥大外，还有肾小球基膜增厚、系膜基质增多及肾内炎症因子增多。这些病理改变导致肾小球硬化及肾小管基质硬化，进而导致终末期肾病[4]。本研究采用高脂喂养诱导大鼠肾脏脂毒性，发现HF组大鼠体质量、FFA水平明显升高，MAU、ACR升高，同时造成肾脏损害；小檗碱使上述改变明显改善。

小檗碱是从黄连或黄柏皮中提炼出来的一种异喹啉生物碱，临床上主要用于治疗腹泻。近年来的研究[9]发现，小檗碱具有降糖、改善胰岛素敏感性、降血脂、减小体质量、减轻炎症、抗氧化应激的作用。本研究得出相似结论，提示小檗碱有望成为治疗肾病的药物。目前认为，小檗碱对糖尿病肾病患者的肾功能有保护作用，主要分子机制如下：(1)小檗碱通过AMPK途径、EP4-Gαs-cAMP信号通路等[10-11]减轻炎症反应及抗氧化应激，进而保护肾功能；(2)小檗碱通过调控β-抑制素、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)/血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、 基质金属蛋白酶(MMPs)及组织抑制因子(TIMPs)等[12-13]保护肾功能。本课题组前期研究[4,14]显示，小檗碱通过AMPK途径改善胰岛素抵抗及提高脂联素水平，进而减轻高脂喂养大鼠的肾损害。本研究显示，小檗碱可以降低高脂喂养大鼠的IL-1、TNF-α、IL-6的水平；Pearson相关分析显示，ACR与GLU、IL-1、TNF-α、IL-6正相关；进一步logistic多因素回归分析显示，IL-6与ACR独立相关。上述研究提示，小檗碱减轻高脂喂养大鼠肾脏损伤可能与其改善肾脏炎症状态有关。

在肾脏缺血灌注损伤中，TLR4/NF-κB通路起主要作用，通过激活TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等炎症因子，损害肾脏细胞，诱导其凋亡[2]。炎症和纤维化是糖尿病肾病的主要特征。研究[3]显示，TLR2通过TGF-β促进糖尿病肾病炎症和纤维化的发生及发展。本研究显示，高脂喂养可以减少大鼠肾脏组织TLR4、TLR2的表达，增加NF-κB、TGF-β的表达，而小檗碱可以逆转这一趋势。本研究中高脂喂养减少TLR的结果与以往文献[2]相悖，原因可能与肾脏损害状态不同有关：本研究中高脂诱导肾毒性，引起肾脏慢性炎症反应；而文献[2]采用缺血再灌注损伤或链脲霉素(STZ)诱导肾脏发生急性炎症应激反应。这两种状态对TLR的影响可能不同，但有待进一步研究证实。

综上所述，本研究初步显示，小檗碱能减轻高脂喂养大鼠的肾脏损伤，这可能与小檗碱减轻肾脏炎症反应有关。小檗碱能促进大鼠肾脏组织TLR4、TLR2的表达，抑制NF-κB及TGF-β的表达，抑制炎症因子的释放及组织纤维化，进而改善高脂肾脏损害。