常规钴60照射对胶原蛋白膜稳定性的影响

苏佩清, 孙卫东, 蒋红心, 乔 明, 周晓霞

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225000; 2. 扬州大学临床中医学院, 江苏 扬州, 225000)

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最高、分布最广泛的蛋白质，占人体或其他动物总蛋白的20%～30%[1]。胶原蛋白膜作为一种新型生物材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性及机械性能，在医用生物材料领域得到广泛的应用[2-3]。医用材料要求灭菌处理，目前胶原生物材料常用的灭菌方法有环氧已烷灭菌法、射线辐照法等[4]。经医用钴60(60Co)辐照处理后，不仅能达到对胶原蛋白灭菌、交联的效果，还能使胶原分子链断裂变性。本研究探讨常规60Co辐照灭菌方法对胶原膜性能的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 胶原蛋白膜的制备: 取新鲜牛肌腱，去除筋膜后冷冻切片, 37 ℃条件下采用胃蛋白酶消化24 h。将消化的腱片用0.5 mol/L醋酸溶胀、混匀，加饱和氯化钠(NaCl)沉析胶原蛋白。透析沉淀液，提纯胶原蛋白并保持其浓度为20.0 mg/mL, 注型成膜。

1.1.2 胶原酶液和胰蛋白酶液的配制: 胶原酶和胰蛋白酶购自Sigma公司，采用pH值7.4的0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液分别将胶原酶和胰蛋白酶配制成酶活力单位为20.0 units/mL胶原酶应用液和0.25% mg/mL的胰蛋白酶应用液。

1.1.3 实验动物: 昆明种小鼠20只，体质量(30±2) g, 由扬州大学医学院动物室提供，实验动物使用许可证号为SYXK(苏)2016-0019。

1.2 实验方法

1.2.1 灭菌处理: 按照2000版《中华人民共和国药典》中医疗器械辐照灭菌方法及《GB 18279-2000》中医疗器械环氧乙烷灭菌方法对胶原膜进行灭菌。辐照剂量率为22 KGy/h, 吸收剂量分别为5、10、15、20、25 KGy。

1.2.2 溶胀度测定: 应用打孔器将胶原样品制成直径1 cm的圆片，将胶原圆片初始重量(W0)的胶原膜浸泡于蒸馏水中0.5 h, 取出后用滤纸将胶原膜表面水分吸干，称重(W)。溶胀度(S)=W/W0。

1.2.3 收缩温度测定: 将胶原样品切成1 cm×5 cm的长条，装入盛有蒸馏水的烧杯中，从25 ℃升温，升温速度1～2 ℃/min, 当样品明显收缩时记录温度为收缩温度。

1.2.4 酶解时间测定: 应用打孔器将胶原样品制成直径1 cm的圆片，之后将胶原圆片和胶原酶液(20 units/mL)或胰蛋白酶(0.25% mg/mL)加入小试管中，记录37 ℃恒温条件下酶解至样品完全分解所需的时间为酶解时间。

1.2.5 胶原膜皮下埋植降解实验: 无菌条件下，分别将照射灭菌(25 KGy)和环氧乙烷灭菌的胶原蛋白膜用打孔器制成直径1 cm的圆片。将昆明种小鼠20只随机分为环氧乙烷灭菌组和常规60Co照射组，每组10只。小鼠用乙醚麻醉后固定，背部正中消毒、去毛，手术剪开约1 cm的纵行切口，止血后用眼科剪分离皮肤与筋膜并将胶原膜片放入右侧皮下，肠线缝合2针，小鼠清醒后正常饲养。分别于术后第10、20天断颈处死小鼠，剪开皮肤观察胶原蛋白膜片的降解情况，拍照留图像资料。

1.2.6 扫描电镜观察照射前后胶原蛋白膜孔径的变化: 扬州大学检测中心代为检测。

2 结 果

胶原蛋白膜经医用60Co辐照处理前后的溶胀度和收缩温度结果见表1。结果显示，经不同辐照剂量60Co照射后的胶原蛋白膜溶胀度随照射剂量加大而增加，不同辐照剂量胶原膜的收缩温度随照射剂量加大而减少，差异均有统计学意义(P<0.01)。不同辐照剂量前后胶原膜的胶原酶和胰蛋白酶的酶解时间见表2。结果表明，胶原蛋白膜经不同辐照剂量的60Co辐照后，其抗胶原酶和胰蛋白酶的酶解时间较辐照前均减少，并与辐照剂量呈正相关，差异有统计学意义(P<0.01)。术后第10天观察各组胶原膜片轮廓清晰，但常规60Co照射组的膜片明显小于环氧乙烷灭菌组，说明常规60Co照射组胶原膜片的降解速率明显快于环氧乙烷灭菌组。术后第20天观察环氧乙烷灭菌组的膜片仍清晰可见并可完整剥离，而常规60Co照射组的膜片轮廓已不清晰，剥离时成型性差。见图1。扫描电镜图显示，照射过(25 KGy)的胶原膜与未照射过的胶原膜相比较，其孔径明显变大。见图2。

表1 辐照前后及不同辐照剂量对胶原膜的溶胀度和收缩温度的影响

与照射前比较, **P<0.01。

表2 不同辐照剂量对胶原膜和胰蛋白酶的酶解时间影响

与照射前比较, **P<0.01。

3 讨 论

胶原蛋白膜作为一种新型生物材料，具有良好的生物安全性和可降解性[5-8]。医用材料均需要消毒灭菌。射线辐照法具有操作安全、不污染环境、杀菌彻底无残留、可对热敏材料灭菌等优点[9]。

溶胀度可以反映胶原膜的交联度，溶胀度越大表明交联度越低[10]。本研究结果表明，不同剂量60Co辐照后，胶原蛋白膜的溶胀度均增加，并与辐照剂量呈正相关，说明常规60Co辐照后胶原蛋白膜的交联度减少。扫描电镜图也能反映交联度，本研究结果表明常规60Co辐照后的胶原蛋白膜孔径变大，交联度变小。

A. 环氧乙烷灭菌组第10天

B. 环氧乙烷灭菌组第20天

C. 常规60Co照射组第10天

D. 常规60Co照射组第20天

图1 环氧乙烷灭菌组与常规60Co照射组术后第10、20天胶原膜片的降解情况

F. 照射25 KGy

图225KGy照射胶原膜与未照射胶原膜的电镜图比较

收缩温度可间接反映胶原熔点温度，每一种胶原都有其特定的熔点温度。胶原蛋白膜收缩温度取决于胶原交联程度和结晶度、胶原纤维的有序性、胶原的降解变性程度[11]。本研究结果表明，不同剂量60Co辐照灭菌后，胶原膜的收缩温度均降低，这可能是由于采用常规60Co辐照灭菌胶原膜时，γ射线可造成肽链的断裂，胶原纤维的有序性降低，胶原蛋白的空间结构松散变性。因此采用常规60Co辐照灭菌法，而不采用任何保护胶原蛋白膜的措施，胶原蛋白将因降解变性而遭到一定程度的破坏。

胶原酶和胰蛋白酶的酶解时间可反映胶原蛋白膜交联度[12]。有研究[13]报道，经常规60Co辐照胶原膜的交联度和稳定性增加。本研究结果显示，常规60Co辐照后的胶原蛋白膜的体外酶解时间均减少，并与辐照剂量呈正相关。将胶原膜在小鼠皮下埋植10、20 d后观察可见，与环氧乙烷灭菌比较，60Co照射的胶原蛋白膜的降解速率明显加快。体内、体外实验结果表明，常规60Co辐照后可使胶原膜的交联度减少，稳定性降低，明显加快了胶原蛋白膜的降解速率。

在辐射能的作用下，聚合物大分子链既可以发生交联反应，也可以发生分子链的降解反应。发生交联还是降解主要取决于聚合物的结构和辐照方法。有研究[14]报道，在低温条件下，胶原膜经60Co射线辐照处理，在一定的剂量范围内(15～25 KGy)胶原膜的交联度增加，胶原分子的有序性增加，抗胶原酶酶解能力增加，稳定性增加。Magda J等[15]研究表明，适当剂量的γ射线辐照可以显著提高湿态胶原蛋白膜的交联度，对结构的破坏很少。但是对干态样品，则会引起胶原蛋白的变性和有序结构的破坏。

本研究结果表明，60Co辐照灭菌处理的胶原蛋白膜的交联度下降，分子稳定性降低，其分子结构的降解程度与辐射剂量呈正相关。