核仁纺缍体相关蛋白1在结肠直肠癌中的表达及临床病理意义

蒋浩海, 肖 锋, 顾春燕, 周林森, 高一飞, 穆向明

(1. 江苏省盐城市第一人民医院 普外科, 江苏 盐城, 224001;2. 南通大学附属南通第三医院 病理科, 江苏 南通, 226006)

核仁纺缍体相关蛋白1(NuSAP1)是一种微管结合蛋白，主要表达于增殖细胞，其mRNA和蛋白水平在G2/M期到达峰值，此后迅速下降，在纺锤体组装中发挥重要功能，是保证细胞周期正常进行的重要调控分子[1]。近年来研究[2]发现，许多肿瘤中存在NuSAP1过表达，其表达水平与肿瘤的增殖和侵袭有关。本研究探讨NuSAP1在结肠直肠癌中的表达及其与临床病理参数的相关性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2011年12月—2015年12月南通大学附属南通第三医院经手术切除的结肠直肠癌(CRC)患者标本116例，经患者知情同意，并通过本院伦理委员会批准。组织标本经10%中性福尔马林液固定、常规组织学处理、石蜡包埋、5 μm厚度组织切片、苏木精-伊红(H&E)染色。收集上述样本中14例癌组织及相应癌旁组织新鲜标本, -80 ℃冻存，本组病例年龄31～89岁，男80例，女36例。

1.2 实时荧光定量PCR检测

按Trizol(美国Invitrogen公司)说明书抽提组织总RNA, 紫外分光光度仪测定RNA浓度并定量，按逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书行逆转录反应合成cDNA。NuSAP1、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由上海英骏生物工程公司合成。NUSAP1: 上游引物5′-TCATTTCCTTTTCTTGCCTCA-3′, 下游引物5′-CCCTCAAGTACAGTGACCTGC-3′。GAPDH: 上游引物5′-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3′, 下游引物5′-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3′。每个样本设3个复孔。反应条件为94 ℃下5 min, 94 ℃下45 s, 60 ℃下1 min, 32个循环, 72 ℃下10 min。

1.3 免疫组织化学检测及结果判定

通过检查相应的H&E染色切片，选择CRC代表性组织块进行免疫组织化学染色，采用Envision二步法，参照试剂盒说明书(上海基因科技有限公司)进行。实验设阳性和阴性对照。阳性信号定位于细胞核，采用“双盲”法进行评定。显微镜下评估阳性染色细胞的百分比和染色强度。染色强度分级: 0, 无染色; 1, 轻度染色; 2, 中度染色; 3, 强染色。阳性染色细胞的百分比分级为: 1为0～25%, 2为>25%～50%, 3为>50%～75%, 4为>75%～100%。将染色阳性的肿瘤细胞百分比评分乘以染色强度评分，最后的评分0～4分为低表达, 5～12分高表达。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 NuSAP1 mRNA在CRC组织、癌旁组织中的表达水平

检测NuSAP1 mRNA在14例CRC组织和癌旁组织中的表达，结果显示NuSAP1 mRNA在癌组织中表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01)。CRC组织中NuSAP1的相对表达量为(1.34±0.44), 而癌旁组织中相对表达量为(0.77±0.26), 差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 免疫组织化学检测NuSAP1蛋白在CRC组织中的表达及细胞定位

进一步运用免疫组化法检测NuSAP1蛋白在116例CRC组织中的表达情况，结果显示NuSAP1蛋白阳性信号定位于细胞核(图1)。NuSAP1蛋白在116例CRC组织中低度阳性表达67例，高度阳性表达49例; NuSAP1蛋白在116例CRC癌旁组织中均呈低表达。NuSAP1蛋白在CRC组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.01)。

2.3 NuSAP1表达与结肠直肠癌临床病理参数的关系

分析NuSAP1与CRC临床病理参数的相关性，结果显示NuSAP1蛋白表达与CRC分化差、淋巴结转移和TNM分期高呈显著正相关(P<0.01), 与CRC患者年龄、性别、肿瘤最大径、部位、Ki-67增殖指数无显著相关性。见表1。

A: NuSAP1表达于细胞核，显示中分化腺癌低表达水平(50倍); B: 图A局部放大，显示少量癌旁细胞核阳性表达(200倍);C: 图A局部放大，显示癌细胞核阳性表达(200倍); D: 显示NuSAP1在低分化腺癌组织中高表达水平(50倍);E: 图D局部放大，显示癌旁组织中少量细胞核阳性(200倍); F: 图D局部放大，显示癌组织高表达(200倍)
图1免疫组化检测NuSAP1在CRC癌组织和癌旁组织中的表达和定位(Envision二步法)

表1 NuSAP1表达与结肠直肠癌临床病理参数的相关性

与同一参数另一亚项比较, **P<0.01。

3 讨 论

NuSAP1的正常表达对于维持正常细胞周期是很重要的[3], 其高表达会导致微管聚集成束，造成多种细胞的M期阻滞。谢萍等[4]利用NuSAP1基因特异性探针在人类56种正常组织中进行斑点杂交，显示NuSAP1高表达于胸腺、胎肝、骨髓等免疫组织及造血组织中，而在脑、成人肝、肾等组织中几乎无表达。Vanden等[5]报道敲除NuSAP1基因会导致小鼠胚胎致死, NuSAP1基因敲除的细胞中纺锤体不能正确组装而使细胞周期持续停滞于分裂期，最终导致细胞凋亡，表明NuSAP1是保证细胞周期正常进行的重要调控分子。

微序列分析[6]表明与分化良好的纤维型星形细胞瘤相比，分化差、侵袭性强的胶质母细胞瘤组织中的NuSAP1是一个过表达基因。在乳腺癌中, NuSAP1通过调控BRCA1蛋白的表达水平，能够导致肿瘤的发生和进展[7]。在三阴性乳腺癌中, NuSAP1过表达提示预后差[8]。NuSAP1在肝细胞癌(HCC)中的表达情况也有少量报道, Satow等[9]研究表明，与非癌组织相比，患者HCC组织中也存在NuSAP1 mRNA表达的上调。张猛等[10]、Xie P[11]的研究显示，在肝细胞癌组织中亦存在NuSAP1 mRNA及蛋白的过表达，并且与肿瘤的侵袭性及早期复发相关。本研究显示, NuSAP1基因和蛋白在CRC中的表达上调，与癌细胞分化差、淋巴结转移呈正相关，与NuSAP1在星形细胞瘤和乳腺癌中的数据是相似的，表明NuSAP1可能参与相关肿瘤的分化、侵袭等过程。

在NuSAP1微管结合域存在2个细胞周期蛋白激酶磷酸化位点, NuSAP1磷酸化或去磷酸化状态在细胞周期过程中受到精确的调控，并且对于细胞周期进程是至关重要的。在有丝分裂早期, NuSAP1被周期蛋白依赖性蛋白激酶1(CDK1)或细胞周期检定点激酶(ATM)磷酸化，这种磷酸化阻止了NuSAP1与微管的连接，保证了微管结构能够维持动态变化; 在有丝分裂中期至后期转换过程中, NuSAP1发生去磷酸化，去磷酸化NuSAP1能促进纺锤体中心区的形成，从而保证正常细胞周期进程[12-16]。细胞周期转录相关因子(E2F1)能够通过结合NuSAP1启动子而增加NuSAP1表达，进而促进前列腺癌细胞增殖; 过表达视网膜母细胞瘤基因(RB1)或者抑制E2F1表达都能够引起NuSAP1表达降低。上述结果表明, RB1是NuSAP1上游分子，可以通过RB1/E2F1信号途径影响NuSAP1表达，进而调控细胞的增殖和侵袭能力[17-21]。

综上所述, NuSAP1在CRC组织中高表达，可能参与CRC分化、转移过程。进一步明确NuSAP1在CRC中的作用机制，将有助于认识NuSAP1在CRC中发挥的生物学功能，为临床寻找新的治疗靶点提供思路。