降酸酵母菌Yds-10最佳培养基的筛选①

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(佳木斯大学 生命科学学院，黑龙江 佳木斯 154007)

0 引 言

葡萄酒都含有酸味物质，其对于葡萄酒的口感、稳定性和陈酿特性具有重要作用。适量的酸味物质是构成葡萄酒爽利、清新等口感的要素[1]。酸度过低，酒体则会平淡乏味；酸度过高，酒体口感生硬粗涩。葡萄酒中的有机酸种类繁多，主要包括酒石酸、苹果酸、柠檬酸，其中对口味影响最大的是L-苹果酸。而降酸酵母菌可以通过苹果酸乳酸发酵，使葡萄酒中的苹果酸转化成乙醇和二氧化碳，降低苹果酸浓度，改善葡萄酒的口味[2]。降酸酵母菌Yds-10是从东北山葡萄酒中筛选出的具有一定降酸能力的酵母菌，为了获得更多的培养物，研究对其最佳培养基进行筛选和优化，旨在为降酸酵母菌Yds-10的应用培养探究最佳培养基配方。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 试验用菌

降酸酵母菌Yds-10：学院发酵实验室筛选保存高降酸能力酵母菌。

1.1.2 仪 器

高温灭菌器，恒温培养箱，低速台式离心机TDZ4-WS，分光光度计等。

1.1.3 培养基

(1)活化培养基[3](g/L)：葡萄糖20，酵母浸粉5，于0.1MPa灭菌20 min。

(2)山葡萄汁培养基(g/L)：在灭菌活化培养基中加灭菌山葡萄汁50mL。

(3)麦芽汁培养基(g/L)：在活化培养基中加浓度为12%的麦芽汁50mL。

(4)马铃薯培养基[4](g/L)：在活化培养基中加20%马铃薯浸汁50mL。

(5)YPD培养基[3](g/L)：大豆蛋白胨4，胰蛋白胨4，酵母浸粉3，葡萄糖20于0.1MPa灭菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 山葡萄汁的制备及灭菌

(1) 果汁的制备 取无霉坏的山葡萄，去梗，清洗，破碎，用纱布过滤，倒入离心管中，于2500r/min离心10min，取上清液备用。

(2) 果汁灭菌 将装有果汁带盖的试管置于90℃恒温水浴锅，保温30min，取出自然冷却至室温；重复3次，取上清液备用。

1.2.2 菌种活化与接种

(1) 菌种活化 将降酸酵母菌Yds-10接种至活化培养基中，于28℃恒温箱培养24h进行活化，取出备用。

(2) 接种 取活化后菌悬液于离心管中，3000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀的菌接种于灭菌的培养基，接种量10%。

1.2.3 基础培养基的筛选

按1.2.2接种方法将降酸酵母菌Yds-10分别接种于活化培养基、葡萄汁培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基和YPD培养基中，测28℃下培养24 h和48 h降酸酵母菌Yds-10的生长量，每种培养基重复培养三份，结果取平均值。

1.2.4 单因素试验

不改变YPD培养基中其它成分的用量，分别对葡萄糖(10、20、30、40、50)g/L、蛋白胨(0、2.0、4.0、6.0、8.0)g/L、胰蛋白胨(0、2.0、4.0、6.0、8.0)g/L及酵母浸粉(0、2.0、4.0、6.0、8.0)g/L的添加量进行单因素试验。测28℃下培养24 h和48 h培养液降酸酵母菌Yds-10的生长量，重复培养每种培养基各三份，取其平均值。

1.2.5 正交试验

在单因素试验基础上，对YPD培养基成分葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨进行四因素三水平正交试验L9(34)，因素水平设计见表1.

表1 正交试验因素水平

1.2.6 检测方法

菌体生长量测定[5]：采用测定光密度值的方法。 将培养液从培养箱中取出，摇晃均匀后立即倒入带刻度、灭菌、干燥的离心管中，每个离心管倒入5mL培养基悬浮液，于3000r/mim离心10min后，弃去上清液，用无菌水定容至10mL，摇均，倒入比色管中，以无菌水做空白对照，立刻放入可见分光光度计中，在波长600nm下测定其的光密度值(OD600)。

2 结果与分析

2.1 基础培养基的筛选

测降酸酵母菌Yds-10在基础培养基、山葡萄培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基和YPD培养基中生长量光密度值OD600，结果见表2。

表2 基础培养基的筛选结果

分析表2，在接种量相同，培养时间相同的情况下，比较降酸酵母菌Yds-10在五种培养基中培养中培养24h和48h培养的生长量及三次测量结果的平均值，YPD培养基的生长量OD600值最高，高于基础培养基、山葡萄培养基、麦芽汁培养基和马铃薯培养基四种培养基，YPD培养基生长量OD600值培养24h和48h的测量结果的平均值为1.035，比活化培养基高出0.322，故选择YPD培养基作为降酸酵母菌Yds-10初筛基础培养基。

2.2 单因素试验

2.2.1 葡萄糖加量

在保持YPD培养基其它成分不变的情况下，对YPD培养基中的葡萄糖进行单因素试验，测培养24 h和48h培养液的OD600值，并计算两个时间段测量结果的平均值，结果见图1。

图1 葡萄糖单因素试验结果(OD600值)

由图1得出，不同葡萄糖加量的五个培养基培养培养降酸酵母菌Yds-1024h和48h培养液的平均OD600值分别为0.886、0.946、1.053、1.054、1.059，随着葡萄糖加量增加，培养液平均OD600值逐渐增大，但后三组之间差异不大、增大的不明显。即葡萄糖加量小于30g/L时，随着葡萄糖加量增加培养液OD600值增大显著；葡萄糖加量大于30g/L时，随着葡萄糖加量增加培养液OD600值增大不显著；故葡萄糖加量取30g/L即可。

2.2.2 酵母浸粉加量

保持YPD培养基其他成分不变的情况下，对YPD培养基中的酵母浸粉进行单因素试验，测培养24 h和48h培养液的OD600值，并计算两个时间段测量结果的平均值，结果见图2。

图2 酵母浸粉单因素试验结果(OD600值)

由图2得出，不同酵母浸粉加量的五个培养基培养培养降酸酵母菌Yds-10 24h和48h培养液的平均OD600值分别为0.741、1.016、0.911、0.802、0.812，五种培养液的OD600值差异较明显；酵母浸粉加量为2.0g/L时，培养液OD600值最大；故酵母浸粉加量取2.0g/L较适宜降酸酵母菌Yds-10的生长。

2.2.3 蛋白胨加量

在保持YPD培养基其他成分不变的情况下，对YPD培养基中的蛋白胨进行单因素试验，测培养24 h和48h培养液的OD600值，并计算两个时间段测量结果的平均值，结果见图3。

图3 蛋白胨单因素试验结果(OD600值)

由图3可知，不同蛋白胨加量的五个培养基培养培养降酸酵母菌Yds-10 24h和48h培养液的平均OD600值分别为0.672、1.072、1.002、0.887、0.812，随着蛋白胨加量增加，培养液平均OD600值呈正态分布，并且五组之间有较明显差异；蛋白胨加量为2.0 g/L时，培养液OD600值最大；故蛋白胨加量取2.0 g/L较适宜降酸酵母菌Yds-10生长。

2.2.4 胰蛋白胨加量

在保持YPD培养基其他成分不变的情况下，对YPD培养基中的胰蛋白胨进行单因素试验，测培养24 h和48h培养液的OD600值，并计算两个时间段测量结果的平均值，结果见图4。

图4 胰蛋白胨单因素试验结果(OD600值)

由图4得出，胰蛋白胨加量不同的五个培养基培养培养降酸酵母菌Yds-10 24h和48h培养液的平均OD600值分别为1.011、1.014、0.905、0.887、0.812，胰蛋白胨加量为2.0 g/L，培养液平均OD600值最大；之后三组随着胰蛋白胨加量增加；培养液OD600值逐渐减小；故胰蛋白胨加量为2.0 g/L较适宜降酸酵母菌Yds-10生长。

2.3 正交试验

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨进行四因素三水平正交试验，测28℃培养24h培养液的OD600值，结果见表3。

表3 L9(34)正交结果分析

通过对表3极差R分析可得，RA>RB>RC>RD，葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨四个因素对降酸酵母菌Yds-10的影响主次依次为：葡萄糖 > 酵母浸粉> 蛋白胨 > 胰蛋白胨；A因素列：K2>K3>K1，B因素列：K2>K1>K3，C因素列：K2>K3>K1，D因素列：K1>K3>K2，因此，培养基配方正交试验结果最优组合为A2B2C2D1，对正交试验结果表3直接观查可得：试验组4(A2B1C2D3)数据最好。

2.4 验证试验结果

对培养基配方组合A2B2C2D1和培养基配方组合A2B1C2D3进行对比验证试验，并以YPD培养基培养结果为对照，测培养24 h和48 h培养液的生长量OD600值，结果见表4.

表3 验证试验结果

分析表4可得，培养24 h和48h培养液的生长量OD600值及两个时间段测得的生长量OD600值的平均值，均为试验组A2B2C2D1好于试验组A2B1C2D3好于 试验组YPD，试验组A2B2C2D1培养液的OD600值的平均值比YPD试验组高0.041。因此，优化培养基配方的最佳组合为A2B2C2D1，即葡萄糖30g/L、酵母浸粉2.0g/L、蛋白胨2.0g/L、胰蛋白胨0g/L。

3 结 论

通过对降酸酵母菌Yds-10最佳培养基的筛选优化可知，培养基的成分及填加量对降酸酵母菌Yds-10的生长有影响。葡萄糖对其影响较大，其次是酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨；葡萄糖加量并不是越多越好，单因素试验和正交试验均显示葡萄糖加量为30g/L好于10g/L、20g/L、40g/L、50g/L；蛋白胨、胰蛋白胨的加量，也不是越多越好，在单因素试验中胰蛋白胨加量0g/L时，降酸酵母菌Yds-10的生长量与2.0g/L加量差别不明显，并且随着加量增多生长量明显下降，正交试验和验证试验与单因素试验结果一致，最终优化培养基胰蛋白胨加量0g/L；蛋白胨加量在单因素试验中2.0g/L明显好于0g/L、4.0g/L、6.0g/L、8.0g/L，正交试验与单因素试验一致，最好为2.0g/L。通过单因素试验、正交试验以及验证性试验得降酸酵母菌Yds-10最佳培养基配方为：葡萄糖30g/L、酵母浸粉2.0g/L、蛋白胨2.0g/L、胰蛋白胨0g/L。此培养基培养降酸酵母菌Yds-10，其培养液的OD600值比YPD培养基高4.1%。