盐碱环境下鱼类氮排泄机制研究进展

么宗利，衣晓飞，来琦芳，周 凯，高鹏程

(中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，盐碱地渔业工程技术研究中心，上海 200090)

动物机体必须有效排泄蛋白质代谢产物氨(NH3和NH4+)来避免其在体内积累中毒。为避免氨中毒，陆生动物消耗大量能量将氨转变为尿酸或尿素排泄。然而水生动物包括大部分鱼类直接将氮废物以氨的形式排泄。在排氨过程中，外界水环境作为“氨槽(ammonia pool)”使鱼体内的氨连续排出[1]。鱼类如何排泄有毒蛋白质代谢产物(主要是氨和尿素)一直是鱼类生理学领域研究的焦点问题[2]。除了排尿素的软骨鱼类和一些特殊硬骨鱼类(如海湾豹蟾鱼Opsanusbeta[3]和马加迪湖罗非鱼Oreochromisalcalicusgraham[4])以尿素形式排泄氮代谢产物外，鱼类在水环境中主要以氨的形式排泄蛋白质代谢产物[5]。最初人们认为，氨和尿素主要依靠分压和浓度梯度经组织上皮排泄到体外，后来研究发现它们的排泄需要借助载体蛋白：氨排泄依赖Rh等蛋白[6]，尿素排泄依赖Ut (Urea transporter)等蛋白[7-9]。氨和尿素排泄是氮平衡和蛋白质代谢重要指标[10- 11]。研究表明，鱼类氮排泄受pH[12- 13]、盐度[14]、碱度[4, 15- 16]、温度[17]、体质量[18]、摄食[5]以及运动[5]等多种因素的影响，其中盐度和碱度是影响氮排泄的主要因素。为此，本文总结了不同水环境中鱼类的氮排泄机制及盐碱胁迫对氮排泄的影响，并提出了今后的研究方向，以期为盐碱水环境中鱼类氮排泄机制研究提供参考。

1 鱼类氮排泄一般规律

氮废物排泄是鱼类物质和能量代谢的重要环节，氨和尿素是蛋白和核苷酸代谢的重要产物，也是鱼类氮废物排泄的主要形式[19- 20]，表1列出了典型水环境中不同氮排泄形式的代表性鱼类。其它氮代谢产物包括尿酸、肌酸酐、蛋白质[21]、硝酸盐、亚硝酸盐[22]及某些胺类化合物[23]。鱼类氮废物排泄受氮摄入量、水体pH、盐度、温度、环境NH3等多种因素的影响[19]。

表1 不同类型水环境鱼类氮排泄形式Fig.1 Fish nitrogen excretion in different types of water

1.1 氨排泄

氨是鱼类氮代谢的主要终产物，它主要由肝脏、肾脏和肌肉中的α-氨基酸经脱氨基作用产生[31- 32]。海水和淡水硬骨鱼在水中以氨氮形式排泄氮废物，氨氮占总氮废物排泄的60%～95%[33]。以氨氮形式排泄氮废物是硬骨鱼最快、也是最经济的排泄形式[34- 35]。氨不但能以非离子形式的NH3排泄，还可以离子形式的NH4+排泄。与排泄尿素、尿酸相比，鱼类排氨有许多优点：可溶性大、低耗能，此外在淡水鱼类中NH4+与Na+的离子交换在维持水盐平衡中发挥重要作用[32, 36]。硬骨鱼中80%～90%的氨从鳃排泄[35, 37-40]，只有少量氨通过肾脏以尿液形式排出。NAKADA等[41]定位了鳃上的4种Rhesus(Rh)糖蛋白(Rhag，Rhbg，Rhcg1，Rhcg2)，并证明这些Rh糖蛋白参与了鳃中氨的排泄。当遇到特殊环境，一些鱼也可以通过皮肤排泄氨，有研究发现潮间带的穴栖无眉鳚(Lipophryspholis)在干露环境中通过皮肤排泄的氨提高到45%，鳃排氨功能减弱[34]；虹鳟(Oncorhynchusmykiss)在高氨环境中也能通过皮肤转运氨[42]。鱼类氨排泄已经研究了80多年，但是相关机制仍然存在争议。最初人们认为鱼类的氨排泄仅依靠自由扩散，在细菌、酵母以及植物细胞中具有氨转运功能的Rh蛋白的发现以及鱼类鳃Rh基因和蛋白的发现为研究鳃中氨排泄机制打开了新局面[36]。氨主要以非游离的NH3形式排泄[43-44]。NH3沿着血液-水扩散梯度穿过鳃上皮的磷脂双分子层扩散出去[35, 45]，氨的排泄率由鳃内外NH3分压梯度决定[46]。

基于淡水鱼Rh蛋白相关研究，WRIGHT等[36]提出了一种氨排泄模型，在这一模型中， Rhag协助NH3顺氨浓度梯度从红细胞中排出。NH3在基底外侧膜Rhbg的作用下穿过基底膜进入鳃上皮细胞，顶端膜上的Rhcg将其转移到水环境中。NH3一旦进入水中，就与通过H+-ATPase和Na+,H+交换蛋白泵出的H+结合形成NH4+。这种氨泵保持了血液-水的氨分压(PNH3)梯度，为Na+吸收提供了电化学驱动力。此外，细胞内的碳酸酐酶、基底外侧的Na+,HCO3-协同转运蛋白和Na+,K+-ATPase间接地作用于氨转运。氨的转运可能还依赖于水边界层的酸捕获机制，而酸捕获机制中的H+可由CO2代谢产生[36]。

与淡水相比，海水中Na+的浓度高出两个数量级。海水的高缓冲能力使进出鳃的水pH变化比淡水鱼小[47-48]。在细胞和分子水平，海水鱼和淡水鱼的离子调控有很大不同[49]，有文献证明海水鱼鳃中NH4+的扩散比淡水鱼更重要[50]。NAKADA等[41]定位了河鲀Rh糖蛋白并推测鳃小片上皮细胞基底膜Rhbg和顶膜的Rhcg2促进NH3扩散，顶膜Rhcg1与通过Na+,K+(NH4+)-ATPase进入鳃小片线粒体富集细胞(MRCs)的NH4+相偶联也促进NH3排出鳃。但是关于NH4+扩散对净排泄的贡献尚有待进一步研究。虽然也有少数关于海水鱼氨排泄机制的研究[51]，但是关于海水鱼的氨排泄模型还需进一步探索。

1.2 尿素排泄

尿素的产生部位主要是肝脏和白肌[52]。在这些组织中尿素可以通过鸟氨酸尿素循环(OUC)以及分解精氨酸和尿酸产生[53-54]。鸟氨酸尿素循环是尿素的合成途径，而精氨酸和尿酸是通过分解作用产生尿素。鉴定排尿素鱼类的标准就是测定其肝脏和肌肉中是否存在OUC酶[谷氨酸合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合成酶III(CPSIII)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶]活性[55]。OUC基因在很多排氨鱼中被保留，但在大部分组织中表达量很低[53, 56]，这种保留有利于一些排氨鱼类在胚胎期排泄尿素以减少胚胎发育期的氨毒性[57-58]。

在淡水和海水硬骨鱼中，氨占氮废物排泄的60%～95%，其余大多以尿素形式排泄[33, 54]。大部分硬骨鱼是非泌尿和非排泄尿素的。只有广盐性的软骨鱼[59-60]以及非常少的硬骨鱼如海湾豹蟾鱼(Opsanusbeta)[61]、马加迪湖罗非鱼(Alcolapiagrahami)[62]排泄尿素，其中后者是已知的100%排尿素鱼类[4, 63- 64]，非洲肺鱼(Protopterusannectans)在正常条件下泌尿排氨[65-66]。另外，一些在成鱼阶段排氨的硬骨鱼(如虹鳟)，在胚胎时期也会以尿素形式排泄氮废物。皮质醇激素在调节氨和尿素的转变过程中发挥重要作用，它能够调节海湾豹蟾鱼的尿素排泄[67]。

一般鱼类的尿素排泄发生在含有较多尿素转运蛋白的鳃部，这些转运蛋白类似哺乳动物肾脏中的尿素转运蛋白(Uts)[52, 59]。尿素不是持续排泄的，而是以间隔脉冲的方式从鳃中排出，1～2 d发生一次，持续0.5～3 h，这表明鳃细胞膜上相关转运蛋白的活动是周期性的[61]。另外还有少量的尿素以尿液形式从肾脏排出，在肾小管中尿素的重吸收与Na+吸收相耦合[68]。

先前许多学者认为尿素排泄是通过细胞膜扩散转运，随着研究手段的进步，有研究发现尿素通过鳃上尿素转运蛋白Ut排泄[69]。最初Ut基因的表达在斑马鱼(Daniorerio)中被证明，BRAUN等[70]采用Ut基因表达沉默技术，使斑马鱼尿素排泄减少90%，明确了转运蛋白和尿素转运之间的关系。除了通过尿素转运蛋白排泄尿素，Na+,Urea交换是第二种转运方式，这种方式能够保留尿素并维持体内尿素水平[71]。

2 碱度和盐度对氮废物排泄的影响

2.1 碱度对氨排泄的影响

淡水硬骨鱼转移到碱水环境下排氨率会立即降低，血浆氨浓度升高[43, 72- 73]，而且随着胁迫时间延长，这种关系更加明显[74]。造成排氨率降低的原因是，氨排泄主要依赖鳃两侧的NH3浓度梯度通过鳃基底膜和顶膜上的Rh糖蛋白转运[36]，排氨率由NH3分压梯度决定[75]。高碱度导致鳃边界层用于捕获NH3合成NH4+的H+减少[48]。从NH3+H+NH4+(pK=9.5，15 ℃)可以看出，当环境中水的pH升高时，相应鳃外侧水pH升高，使H+浓度降低，NH3NH4+反应朝向NH3侧进行。水中pH升高降低了ΔpH，表现为机体排氨率降低[72]；另一原因是碱水直接作用于鳃的Na+,NH4+转运蛋白，但考虑到NH3扩散在淡水鱼的排氨率中占支配地位，后者的影响可能极小[76- 77]。

2.2 碱度对尿素排泄的影响

碱性环境抑制氨的排泄，然而对尿素的排泄却有促进作用，例如马加迪湖罗非鱼在高碱度环境中以尿素形式排泄所有氮废物。但是在多数鱼类，碱度升高对尿素排泄的增加只是瞬间的[78]。WILKIE等[29]研究证明克拉克大马哈鱼为适应pH 9.4的环境，可能通过提高尿酸分解来增强它们依赖的尿素排泄。同样，虹鳟也缺少鸟氨酸尿素循环功能，在pH 9.5时尿素排泄率加倍。需要强调的是，这种升高的尿素排泄是暂时的，在暴露于高pH 2～3 d后就不复存在[30]。

2.3 盐度对氮排泄的影响

盐度对氨排泄的影响主要通过影响能量代谢和Na+,NH4+交换实现。鱼类在等渗点时渗透调节压力最小，代谢率最低，生长率最高，此时维持内稳态的渗透压调节耗能最少。而远离等渗点时需要消耗更多的能量用于渗透压调节。当盐度导致代谢率增大时，排氨率也随之增加。可能的原因是水生动物对糖类的利用率较低，主要靠蛋白质代谢提供能量，增加的耗能主要靠蛋白质脱氨基作用提供[71]。 此外，为了维持生物体的水盐平衡，鳃上皮具有维持体内Na+稳定性的Na+,NH4+交换系统，需要在NH4+的参与下工作，因此环境渗透压的变化也会在一定程度上导致氨氮排泄率的变化。

盐度主要通过改变渗透压影响尿素排泄。在软骨鱼中，尿素作为主要的渗透调节物质，组成了大于40%的血浆渗透压[2]。鱼体对血浆尿素含量在正常海水环境和盐度变化时都必须严格监管。合成尿素需要消耗大量能量，通过复杂的代谢产率、摄食获取、钠耦合的肾脏再吸收及鳃定向梯度维持保留尿素[79]。有学者推测软骨鱼在盐度变化时不仅需要离子调节，还需要代谢和摄食调控，这些都要改变渗透物质如尿素等的浓度，它们可能比硬骨鱼对变化的盐度适应速度慢，这也说明了硬骨鱼更容易适应盐度变化[80]。在硬骨鱼中，尿素作为渗透物质的作用很小，因此预测盐度对硬骨鱼尿素排泄的影响很小。例如马加迪湖罗非鱼血浆中尿素含量很低，从50%海水转移到淡水的过程中并没有消除尿素排泄[81]。排尿素的海湾蟾鱼能耐受较大的盐度范围，当胁迫盐度范围为20%～200%的海水时，血浆渗透压占总渗透压的比例变化仅为2.4%～5.2%，尿素排泄率保持相对稳定[82]。因此，即使盐度变化，尿素作为渗透物质在硬骨鱼中的作用也很小，盐度对硬骨鱼尿素排泄的影响不大。

3 盐碱环境下鱼类氮废物排泄策略

大多数硬骨鱼类对体内氨水平较敏感[71]。而在诸如凡湖(Van Golu)、马加迪湖(Lake Magadi)、皮拉米德湖(Pyramid Lake)、青海湖(Lake Qinghai)等盐碱度较高的极端环境中，马加迪湖罗非鱼、克拉克大马哈鱼、土耳其塔氏卡拉白鱼(Chalcalburnustarichi)、虹鳟以及青海湖裸鲤等都进化出应对排氨压力的调节机制[83]。虽然这些耐碱鱼类面临相同的挑战，但它们各自进化出了独特的耐碱机制来应对极端碱性环境。

3.1 重建NH3分压梯度——虹鳟、土耳其卡拉白鱼的耐碱机制之一

在中性环境中，虹鳟90%的氮废物通过鳃排泄，其中氨排泄占85%，尿素排泄一般只占10%～20%[33]。碱性环境使血液中氨浓度升高，同时血液pH升高，从而帮助虹鳟重新建立血液-鳃外侧水NH3分压梯度(ΔPNH3)。因此在高pH胁迫下，1～2d后虹鳟会恢复到胁迫前的氨排泄水平[84- 85]。在更加极端的情况下，当NH3和NH4+的浓度急剧升高或者达到毒性水平，体内升高的NH3可能会导致高pH[29, 85]以及Na+和Cl-浓度降低诱导的死亡[86]。凡湖中土耳其塔氏卡拉白鱼血液中高氨水平导致其排氨率极高，可达1 000μmol·(kg·h)-1。研究推测在凡湖碱水中，这种高血氨水平能够促进氨排泄的ΔPNH3形成[72]。然而因为土耳其塔氏卡拉白鱼生活在60%海水盐度的湖水中，它可能依赖NH4+促进氮排泄，而非NH3。

3.2 转变氮代谢产物

3.2.1 尿素排泄——马加迪湖罗非鱼、克拉克大马哈鱼的耐碱机制之一

马加迪湖罗非鱼、克拉克大马哈鱼等进化出特殊机制来解决在碱性环境中的排氨问题。

最极端的例子是马加迪湖罗非鱼，它以尿素形式排泄所有的氮废物[4, 63, 87- 88]，这种特例是因为马加迪湖罗非鱼存在一套完整活跃的鸟氨酸尿素循环辅酶。虽然大部分硬骨鱼都存在鸟氨酸尿素循环辅酶基因，但关键酶通常无活性，或者说缺失某些关键基因[89- 90]。因此很多硬骨鱼产生尿素是通过尿酸分解、嘌呤降解或者是由饮食中精氨酸代谢产生[33, 91]。海湾豹蟾鱼和印度囊鳃鲶也可以通过鸟氨酸循环将氨转换为低毒的尿素，然后以尿素的形式排泄部分或全部的氮废物[92- 93]。

克拉克大马哈鱼在皮拉米德盐碱湖(pH 9.4)中大约25%～30%的氮废物以尿素形式排泄，比典型的淡水硬骨鱼稍高[94- 95]，但鸟氨酸尿素循环的关键酶比如氨甲酰磷酸合成酶Ⅲ含量太低不足以表明鸟氨酸尿素循环的存在。实际上，重要的尿酸分解酶活性表明尿素是通过典型的尿酸分解途径产生[29, 96]。

土耳其塔氏卡拉白鱼37%的含氮废物是以尿素形式排泄，但是它没有鸟氨酸尿素循环途径[97]。因此，这种鱼的尿素生产可能是通过尿酸分解。

瞬间尿素排泄率的提高可能是克拉克大马哈鱼对环境急性pH升高的一种普通的氨解毒反应。WILKIE等[30, 98]证明克拉克大马哈鱼可以适应pH为9.4的环境，但pH达到10会受到挑战，可能通过提高尿酸分解率来提高它们依赖的尿素排泄。同样的，虹鳟也缺少鸟氨酸尿素循环功能，在pH为9.5时尿素排泄率加倍。需要强调的是，这种升高的尿素排泄是暂时的，在高pH环境中2～3 d后就不复存在[30, 98]。

3.2.2 转变为氨基酸—弹涂鱼、蟾鱼等的耐碱机制之一

研究表明当碱性环境造成体内氨浓度升高时，一些鱼类将氨转变成氨基酸储存起来，尤其是谷氨酰胺[4]。谷氨酰胺在氨运载中是一种非常重要的无毒产物。弹涂鱼(Periophthalmuscantonensis)和海湾豹蟾鱼在脑部可以通过它们特别强大的谷氨酸脱氢酶/谷氨酰胺合成酶解毒系统将氨转换成自由氨基酸以耐受体内的高氨含量，这些组织对氨中毒极其敏感[99]。弹涂鱼还可以利用部分氨基酸代谢产生ATP，而利用丙氨酸作为临时的氨槽，因此没有氨释放到环境中[100]。

3.3 高氨耐受能力——马加迪湖罗非鱼、土耳其塔氏卡拉白鱼等的耐碱机制之一

高氨耐受能力也是有助于鱼类生活在高碱度环境中的关键策略。根据尿素排泄机制，马加迪湖罗非鱼可能拥有高氨耐受能力。马加迪湖罗非鱼NH3的LC50大约比大部分硬骨鱼高6倍，这种高氨耐受能力大多与肝脏中谷氨酰胺合成酶的高活性有关[101]。哺乳类和鱼类的一种典型的解氨毒反应就是谷氨酰胺合成酶催化NH4+和谷氨酸合成谷氨酰胺。高谷氨酰胺合成能力对马加迪湖罗非鱼也是非常重要的，因为它提供了尿素形成所必须的OUC酶：氨甲酰磷酸合成酶Ⅲ和谷氨酰胺合成酶[91, 93]。

土耳其塔氏卡拉白鱼也表现出高氨耐受力，其血液(1 mmol·L-1)和肌肉组织(12 mmol·L-1)中能积累高浓度氨。而典型的硬骨鱼肌肉和血浆中氨浓度范围通常在0.6～2.0 mmol·kg-1和50～200μmol·L-1[102- 103]。高尿素排泄率提示其具有较高的尿素生产效率，以及脑部高谷氨酰胺合成酶活性，这可使土耳其塔氏卡拉白鱼拥有不寻常的高氨耐受力[97]。

3.4 其它途径——克拉克大马哈鱼的耐碱机制之一

克拉克大马哈鱼从幼体生活的淡水水域(pH 8.4)转移到皮拉米德湖(pH 9.7)中会永久地降低氮废物生产率，而不是依靠提高尿素排泄或者对血液氨水平有极高耐受力，这种降低体现在血浆氨浓度短暂的升高和氨排泄长期的降低。结果使克拉克大马哈鱼在转移到皮拉米德湖后避免了体内氨潜在的毒性。皮拉米德湖克拉克大马哈鱼可能是通过抑制代谢速率或者依赖其它能源物质例如糖类或脂类降低氨生产[98]。另一可能途径是克拉克大马哈鱼完全抑制了氮代谢，以另一种物质排泄替代了氮废物。尿素或尿酸并不是替代物质，但是有可能克拉克大马哈鱼在转移到皮拉米德湖后排泄了相当多的谷氨酰胺、氧化三甲胺、肌酸或者其它的氮废物[96]。

4 展望

关于淡水鱼和海水鱼在它们各自生存环境中的氮排泄机制已较清晰，然而对生活在盐碱这一特殊环境下鱼类的氮排泄机制研究相对较少，尚未总结出耐盐碱鱼类的氮排泄模型。我国拥有丰富的耐盐碱水生生物资源，为盐碱适应生理机制的研究提供了优良的实验材料，尤其是一些盐碱湖中生存有耐盐碱土著鱼类，如青海湖裸鲤[104]、瓦氏雅罗鱼等[105]。虽然前期对青海湖裸鲤、瓦氏雅罗鱼的氮排泄规律进行了探索，比如发现在高碱环境下青海湖裸鲤表现为暂时性呼吸性碱中毒[106]，裸鲤在高碱环境下前期氮废物排泄受到抑制、但后期会通过启动Rh基因高表达恢复氨氮排泄，同时启动Ut高表达来增加尿素氮排泄来进行氮废物排泄[16]；高碱环境下瓦氏雅罗鱼排氨率下降、血浆中非必需氨基酸的含量升高、Rhcg1和Rhcg2基因表达上调[28]。但有关耐盐碱鱼类的氮排泄机制仍有待于深入研究。对我国的耐盐碱鱼进行氮排泄的研究将有助于构建盐碱水中鱼类的氮排泄机制模型，为揭示鱼类的耐盐碱机理提供基础数据。