定点饱和突变提高L－ 脯氨酸－4－羟化酶的酶活

周海岩，李会帅，王 培，柳志强

（1．浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，生物工程学院，浙江工业大学，浙江 杭州310014；2．生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江 杭州310014）

反式－4－羟基－L－脯氨酸（4－Hyp）是一种应用广泛的高附加值非天然氨基酸［1］。在化工领域4－Hyp可作为手性原料合成多种聚合物［2］。在动物饲料应用上，添加4－Hyp可防止因甘氨酸合成不足而导致的营养不良现象的发生［3］；在医药领域，可作为原料用于合成碳青霉烯类抗生素［4］。此外，4－Hyp还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果［5］，因此许多高级化妆品中都添加有4－Hyp，以期延缓衰老［6－7］。4－Hyp市场需求呈现逐年递增的趋势，目前国内市场售价超过60万元／t。4－Hyp的制备方法主要有蛋白水解法、生物催化和发酵法。蛋白水解法［8－10］是目前4－Hyp的主要制备方法，但其路线长（保护／去保护）、环境污染严重、成本高，得率只有4%～7%。因此，绿色、高效、低成本的4－Hyp的生物合成技术的开发具有广阔的发展前景［11］。4－Hyp的生物合成方法包括生物催化和发酵法［12］，其中高活性L－脯氨酸－4－羟化酶（P4H）的挖掘和开发是生物法合成4－Hyp能否成功的决定性因素。P4H 属于 Fe2＋／α－酮戊二酸（α－KG）依赖型双加氧酶，一般存在于细菌中，可在Fe2＋，α－KG存在的条件下将游离的L－脯氨酸4－位羟基化［13］。Shibasaki等通过高效筛选首次从微生物指孢囊菌RH1中获得了P4H，然后将该基因进行克隆和异源表达，构建了表达P4H的重组大肠杆菌，该菌株在含有底物L－脯氨酸的发酵培养基中进行培养，100h后可积累41g／L 4－Hyp［14－15］。为了降低4－Hyp的生产成本，Shibasaki等在4－Hyp生产中过表达L－脯氨酸合成的关键酶基因，以葡萄糖为碳源发酵96h后，4－Hyp产量达到了25g／L［16］。Yi等尝试了以谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达P4H并生物合成4－Hyp，但结果与重组大肠杆菌相比并不理想［17］。刘合栋等将优化后的P4H基因克隆到含有色氨酸串联启动子的pUC19质粒中，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，在摇瓶水平，重组菌以L－脯氨酸为底物反应8h可积累49．2mg／L的4－Hyp［18］。整体而言，目前发现的P4H较少，且活性较低或稳定性较差。

在前期的工作中，本研究团队首次通过基因挖掘和基因工程技术将来源于Pseudomonas stutzeri DSM 4166的P4H在大肠杆菌中进行可溶性表达，并成功用于4－Hyp的生物转化法合成。为了提高4－Hyp的合成效率，笔者将对该P4H进行定点饱和突变（site－saturation mutagenesis），改善酶的催化活力。定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门新兴技术，它通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶点氨基酸分别被其他19种天然氨基酸替代的突变子［19］。该技术是研究蛋白质结构与功能关系和分子改造的重要手段，已广泛应用于蛋白质功能位点的确定、酶比活力的提高、酶稳定性的改善以及底物结合特异性和立体异构特异性的改变等研究中。定点饱和突变方法包括寡核苷酸定向诱变、盒式诱变、突变引物诱变、重叠延伸PCR和质粒扩增诱变等［19］。笔者采用了设计简并引物、扩增整个重组质粒的方法对P4H进行定定点饱和突变，以改善酶的催化活力，为了减少随机突变，使用了高保真的DNA聚合酶。该方法简单、快捷，适合各种位置的突变。

1 材料与方法

1．1 菌种与质粒

Escherichia coli BL21（DE3）由本实验室保存；质粒pET－28b购自Novagen公司；携带有Pseudomonas stutzeri DSM 4166P4H 基 因 的 重 组 质 粒pET－28b－p4h以及表达P4H的重组大肠杆菌E．coli BL21（DE3）／pET－28b－p4h由本实验室构建并保藏。

1．2 培养基

LB培养基［20］：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物5g／L，氯化钠10g／L，琼脂粉20g／L（固体培养基）；接种含有质粒的重组菌株时添加40μg／mL硫酸卡那霉素（Kan）。

1．3 工具酶和生化试剂

PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺为加拿大BBI公司产品；DpnⅠ限制性内切酶购自Ferments公司；PrimeSTAR?HS DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；Taq DNA聚合酶、dNTPs购自上海博彩生物科技有限公司；λDNA、蛋白酶 Marker、Kan和异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）购自上海生工生物工程公司；酵母提取物和胰蛋白胨为英国Oxoid公司产品；底物L－脯氨酸和产物标品4－Hyp均购自Sigma（上海）贸易有限公司；2－［N－吗啉代］乙磺酸（MES）、抗坏血酸、对二甲基苯甲醛、氯胺和Tα－KG购自北京百灵威科技有限公司；PCR引物合成、P4H基因序列测定由上海生工生物工程公司完成。

1．4 P4H重组菌的培养和全细胞转化合成4－Hyp

将前期构建的P4H重组大肠杆菌接种至装有30mL含有40μg／mL Kan的LB培养基中，37℃，150r／min培养至对数期（8～12h）后，以V（种子液）∶V（培养基）＝1∶20的接种量转入100mL含有40μg／mL Kan的LB培养基中，37℃，150r／min培养6～8h，加入0．1mmol／L IPTG，于28 ℃，150r／min条件下再培养12～16h，进行酶的诱导表达。离心（4℃，9 000r／min，10min），收集菌体进行SDS－PAGE分析和全细胞转化反应［21］。反应体系为：10mL pH 6．5的80mmol／L MES缓冲液，0．35g／L L－脯氨酸，0．8mmol／L FeSO4·7H2O，6mmol／L L－抗 坏 血酸，6mmol／Lα－KG，35 ℃，150r／min反应8h。离心（12 000r／min，5min）反应液，收集上清，利用氨基酸分析仪对产物4－Hyp浓度进行检测。

1．5 突变位点选择和定点饱和突变

搜索蛋白质PDB数据库，选择与P4H序列一致性高于30%的蛋白质晶体结构为模板，利用Modeller 9v7和Easymodeller进行三级结构预测，选取MOLPDF值最小的结构并进行能量最小化，在SAVES服务器（http：／／services．mbi．ucla．edu／SAVES／）中进行评估，最终得到P4H的三级结构模型。通过 HotSpot服务器 （http：／／loschmidt．chemi．muni．cz／hotspotwizard／index．jsp）预测“热点”氨基酸残基，分析“热点”氨基酸的性质以及对蛋白质结构的影响，筛选出待突变的位点。设计含有简并碱基NNK（N＝A／T／C／G，K＝G／T）的引物，采用Stratagene公司的QuikChange?Site－Directed Mutagenesis Kit试剂盒，以重组质粒为模板进行PCR反应，扩增体系为50μL（2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP mixtrure 1μL，正反向引物各2μL，质粒2μL，Phanta Max Super－Fidelity DNA聚合酶1μL，ddH2O补充至50μL）。反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性15s，55～65℃退火15s，72℃延伸6min（延伸时间按1kb／min计算［22］），30个循环；72 ℃再延伸5min，4 ℃保存。PCR产物经DpnⅠ消化后转入BL21（DE3）感受态细胞，感受态细胞参考《分子克隆实验指南》所述方法进行制备［23］。转化后的细胞涂布在含Kan的LB平板上，37℃，150r／min培养8h，构建突变文库。

1．6 阳性突变子的初步筛选

随机挑取95个克隆子和初始菌E．coli BL21（DE3）／pET28b－p4h 分别进行菌落 PCR 验证［24］，将阳性克隆子接入加有1mL LB培养基的96孔板中，37℃，150r／min培养4～6h，加入0．1mmol／L IPTG，于28℃再培养12～16h进行酶的诱导表达。离心（4℃，8 000r／min，10min），收集菌体进行全细胞转化反应，反应体系和条件同1．4，反应液经氯胺T法［25］检测，初步筛选出4－Hyp合成能力提高的突变株，作为初筛目的菌株。

1．7 目的菌株的复筛与鉴定

为了进一步测定初筛菌株的P4H活力，初筛菌株反应液上清中的4－Hyp浓度用氨基酸分析仪进行检测。筛选出4－Hyp浓度最高的突变菌作为复筛目的菌株，对复筛菌株的P4H进行基因测序，明确突变位点的碱基变化，进而确定氨基酸残基的变化。

2 结果与讨论

2．1 P4H重组菌的SDS－PAGE分析和催化合成4－Hyp的进程分析

为了考察P4H重组菌的蛋白表达情况，对E．coli BL21（DE3）／pET28b－p4h菌体细胞进行 SDSPAGE分析，结果表明该重组菌具有表达P4H的能力，见图1（a），进一步对破碎细胞SDS－PAGE分析可知，P4H基本都是可溶性表达，见图1（b）。

图1 全细胞和破碎细胞的目的蛋白表达分析Fig．1 SDS－PAGE analysis of P4Hexpression in whole cell and disrupted cell of E．coli BL21（DE3）／pET28b－p4h

为了对E．coli BL21（DE3）／pET28b－p4h全细胞催化合成4－Hyp的进程进行分析并确定最佳反应时间，分别在反应过程的2，4，6，8，10，12，14，16h取样，对反应上清液采用氨基酸分析仪进行4－Hyp质量浓度的测定，结果如图2所示。4－Hyp的质量浓度呈现先升高后缓慢降低的趋势，在反应进行到8h左右时，4－Hyp的质量浓度达到最大，但仍较低。因此，为了提高 E．coli BL21（DE3）／pET28b－p4h全细胞催化合成4－Hyp的能力，可进一步通过定点饱和突变技术提高P4H的酶活力。

图2 E．coli BL21（DE3）／pET28b－p4h全细胞催化合成4－Hyp的过程曲线Fig．2 Time course of 4－Hyp biosynthesis in catalysis with whole cell of E．coli BL21（DE3）／pET28b－p4h

2．2 P4H三维结构的模拟和突变位点的确定

通过对P4H的三维结构模型（图3）进行氨基酸保守性分析和氨基酸残基理化性质分析，筛选出7个待突变的位点，分别为Y205，K207，I241，F137，T142，V53和R45，通过软件Primer Premier 5．0分别设计每个待突变位点的简并引物，具体引物见表1。

图3 P4H的三维结构图Fig．3 3Dstructure of P4H

表1 定点饱和突变引物1）Table 1 Primers used in site－saturation mutagenesis

2．3 定点饱和突变体库筛选结果与分析

以质粒pET－28b－p4h为模板，选择每一个突变位点相应的引物，使用 Phanta Max Super－Fidelity DNA聚合酶对其进行全质粒扩增，进行1．0%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果见图4。针对突变位点Y205，K207，I241，F137，T142，V53和 R45进行的全质粒PCR扩增，均得到了大小约为6kb的特征条带，这与预期的条带大小一致，说明定定点饱和的全质粒PCR扩增成功。

图4 定点饱和突变PCR扩增电泳图Fig．4 Gel electrophoresis results of plasmid PCR amplification

经限制性内切酶DpnⅠ对PCR扩增产物进行酶切去甲基化，得到pET28b－p4h突变质粒，然后转入到E．coli BL21（DE3）的感受态细胞中，并涂布于含有Kan的LB平板培养基中。37℃，150r／min培养8h，构建突变文库。从该平板上挑取单菌落，以菌落PCR的方式鉴定阳性克隆是否含有目的质粒。在平板上随机挑取单菌落，热解使DNA暴露，经菌落PCR后，用1．0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图5。发现所有的菌落PCR在接近900bp处均有明亮的特异性条带，说明均为阳性克隆子。

图5 菌落PCR电泳图Fig．5 Gel electrophoresis of colony PCR amplification

分别在96孔板中对7个突变位点的665株突变酶菌株进行诱导培养和全细胞催化反应，反应液通过氯胺T方法进行快速检测，结果表明，在7个突变位点的突变库中，共有2个突变位点（Y205和F137）的7株菌的P4H酶活得到提高。通过氨基酸分析仪对7株菌合成4－Hyp的浓度进行了精确测定，用4－Hyp的相对量代表酶活提高的倍数，结果见表2。酶活提高最大的突变酶是F137－41，为原始酶的1．58倍。

表2 突变酶合成4－Hyp浓度和提高倍数Table 2 4－Hyp titer and increased fold of mutant P4H

对于P4H的突变位点F137和Y205，活力最高的 突 变 菌 株 分 别 为 F137－41 和 Y205－90；在0．35g／L L－脯氨酸底物下，生成的4－Hyp的质量浓度分别为55．09mg／L和52．29mg／L，比原始酶分别提高了58%和50%。对这2株菌的P4H基因测序，结果表明，突变酶F137－41的基因序列有两处碱基发生突变，其中，409位的T突变为C，410位的碱基T突变为G，导致137位的氨基酸由Phe突变为 Arg（F137R）；突变酶 Y205－90的基因序列有两处碱基发生突变，其中，613位的碱基T突变为A，615位的碱基C突变为G，导致205位的氨基酸由Tyr突变为Lys（Y205K）。

2．4 P4H突变前后与底物L－脯氨酸的分子对接

Xu等将α－KG／Fe2＋依赖型双加氧酶归类于一种新型的家族，即PF10014，这类酶参与调节抗生素的生物合成和生物膜的形成。在其家族同源结构中，结合Fe2＋和α－KG的氨基酸残基都严格保守，两个组氨酸和一个天冬氨酸协同参与Fe2＋的结合，一个精氨酸与α－KG结合［26］。在本研究中，P4H活性位点为His149，Asp151和His250。比较突变前后的对接结果（图6），发现经过突变（F137R和Y205K）后，酶的活性中心并没有发生明显的变化。这说明酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白质构型发生了轻微改变，增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的，137和205位氨基酸位于P4H蛋白的功能区域。该发现为进一步提高P4H的活力，对三维结构的揭示及对其催化机理的研究奠定了一定的理论基础。

图6 P4H与底物L－脯氨酸的分子对接Fig．6 Autodocking of P4Hand substrate L－proline

3 结 论

为了提高实验室前期构建的P4H重组大肠杆菌合成4－Hyp的效率，对来源于Pseudomonas stutzeri DSM 4166的P4H进行了定点饱和突变。通过搜索蛋白质PDB数据库，获得蛋白晶体结构模板，然后对“热点”氨基酸进行分析，选取了7个位点作为饱和突变靶位点，分别为Y205，K207，I241，F137，T142，V53和R45。采用设计简并引物，全质粒扩增的方法，对P4H进行定点饱和突变，构建突变体库。通过氯胺T方法初筛和氨基酸分析仪检测复筛，获得了酶活分别提高58%和50%的P4H突变体F137R和Y205K。分子对接结果表明，F137R和Y205K突变后，酶的活性中心变化不明显，可能是由于蛋白质结构的轻微改变增加了酶与底物或辅底物的亲和力而使得P4H酶活得到了不同程度的提高。该研究结果为进一步研究P4H的分子改造、酶的催化机制等提供了重要的理论依据。

本文得到浙江工业大学研究生教学改革项目（2018114）的资助。