大肠杆菌发酵中强裂解性噬菌体的分离和鉴定

陈江坡，程江红，康 培，刁刘洋，3

（1．廊坊梅花生物技术开发有限公司，河北 廊坊065001；2．梅花生物科技集团股份有限公司，河北 廊坊065001；3．梅花（上海）生物科技有限公司，上海201203）

噬菌体是一类普遍存在于自然界中的感染细菌并在细菌内完成复制的病毒，数量是细菌的10倍以上［1］。病理学家Twort和微生物学家D’Herelle在1915年和1917年分别独立发现了噬菌体［2］。噬菌体由核酸和蛋白质构成，蛋白质构成的衣壳包裹着核酸，起着保护核酸的作用，并决定噬菌体的外形和表面特征。噬菌体核酸只有一种类型，即DNA或RNA，双链或单链。大部分噬菌体还长有“尾巴”，用来将遗传物质注入宿主体内。根据噬菌体与宿主的关系，可将其分为烈性噬菌体与温和噬菌体。烈性噬菌体通过吸附、侵入、生物合成、装配与释放等步骤使宿主细胞裂解死亡［3］；而温和噬菌体侵染宿主后并不增殖，其基因整合于细菌染色体上，即前噬菌体，随细菌染色体的复制而复制。

在微生物尤其是细菌发酵的工业生产中极易感染噬菌体，目前相关报道主要集中在乳制品工业以及少数的大宗化学品产业，如乳酸、丙酮、丁醇和谷氨酸［4－8］等。感染噬菌体往往导致发酵过程中菌体大量死亡，轻则使发酵周期延长、发酵产量降低，重则造成倒罐、经济损失［9］。笔者有目的地从本公司因污染了噬菌体，而导致苏氨酸发酵（生产菌为MG1655来源的大肠杆菌）停止的车间培养液中分离噬菌体，最终得到一株裂解能力强大的噬菌体，其对大肠杆菌MG1655菌株具有高效裂解效果，对噬菌体进行分离、电镜观察以及核酸类型鉴定，判断该噬菌体属于长尾病毒科噬菌体。通过分析其生物学特性，为得到工业抗噬菌体生产菌奠定基础，可以避免再次被噬菌体污染，从而降低发酵成本、节约能源和人力，保证工业生产的经济利益。

1 材料与方法

1．1 材料及菌株

实验中噬菌体分离所用的样品来源于本公司苏氨酸污染噬菌体车间的培养液。大肠杆菌MG1655由本公司实验室保存。

1．2 培养基、主要试剂和仪器

液体LB培养基：NaCl 10．0g／L，酵母提取物5．0g／L，胰蛋白胨10．0g／L，加蒸馏水定容至1L，121℃，1．15×105Pa灭菌20min。上层LB半固体培养基：在液体LB中加入0．007g／mL琼脂糖。下层固体LB培养基：在液体LB中加入0．015g／mL琼脂糖。DNaseI和RNase A购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司（Thermo Fisher Scientific）；离心机购自sigma公司；君意JY04S－3C凝胶成像分析系统购自北京君意东方电泳设备有限公司；Tecnai Spirit 120kV透射电子显微镜为中科院生物物理研究所所有。

1．3 噬菌体的分离与鉴定

将工业生产菌培养液样品于LB平板上与MG1655交叉划线，确定培养液中是否含有噬菌体。样品4℃，8 000r／min离心10min后使用0．22μm滤膜过滤，利用双层琼脂平板法，以大肠杆菌MG1655菌株作为对照菌，检测样品中是否含有裂解性噬菌体。

1．4 噬菌体的富集及纯化

挑取双层琼脂平板上单个噬菌斑进行反复纯化，直至获得形态和大小一致的噬菌斑。然后不断富集传代，增加噬菌体的浓度。

1．5 噬菌体基因组提取方法

噬菌体DNA提取参考《分子克隆实验指南》。

1．6 噬菌体核酸类型鉴定

分别用DNase I，RnaseA，EcoRI和 HindIII处理提取的噬菌体基因组，37℃消化2h，将消化产物进行核酸电泳。

1．7 噬菌体电镜观察

噬菌体富集传代后，采用磷钨酸负染法，通过透射电子显微镜观察噬菌体形态特征。

2 结果与分析

2．1 噬菌体的验证

将工业生产菌培养液样品于LB平板上与MG1655交叉划线，结果发现培养液中确实含有能够侵染MG1655的噬菌体，如图1所示。

图1 噬菌体MHV4存在的验证Fig．1 The presence of phage MHV4

2．2 噬菌体的分离及噬菌斑特征

工业生产菌培养液样品过滤上清后与大肠杆菌MG1655混合，37℃培养10min。经过双层琼脂平板法分离和纯化，37℃培养12h后，在平板上能形成明显噬菌斑。噬菌斑呈圆形、大而透明且边缘整齐，呈现出裂解性噬菌体的噬菌斑特征（图2）。

图2 噬菌体MHV4噬菌斑形态特征Fig．2 Morphological feature of phage MHV4plaques

2．3 噬菌体核酸类型鉴定

噬菌体 MHV4的基因组分别经 DNase I，RNase A，EcoRI和HindIII处理后进行核酸电泳。电泳结果显示噬菌体MHV4的基因组能被Dnase I完全降解，但经RNase A处理后无明显变化，表明其基因组核酸为DNA。由于噬菌体MHV4的基因组能够被EcoRI和HindIII酶切，表明该噬菌体基因组为双链DNA，其基因组大小为43kb左右（图3）。

图3 噬菌体MHV4核酸类型鉴定Fig．3 Nucleic acid type of phage MHV4

2．4 噬菌体的电镜观察

纯化和富集的噬菌体经磷钨酸负染后，在透射电子显微镜下观察到的形态如图4所示。噬菌体MHV4的头部呈二十面体立体对称，头部直径约70nm，噬菌体含非收缩性尾部，宽约10nm，长约160nm。根据2012年国际病毒分类委员会第9次报告提出的噬菌体分类与命名标准，该噬菌体符合长尾噬菌体科（Siphoviridae）特征。

图4 噬菌体MHV4电镜照片Fig．4 Electron micrograph of phage MHV4

3 结 论

在自然界中，噬菌体与宿主总是共同存在和进化的，两者之间存在着复杂的抗性和逃逸机制［10－11］。噬菌体感染是以细菌为基础的生物技术发展过程中的一个棘手的问题。深入理解噬菌体与宿主之间的相互作用是解决这一问题的关键。目前工业发酵中对噬菌体感染防治主要有以下策略：1）感染源的控制（对取样发酵液和分析后的发酵液都要灭菌处理后再排放，要注意空气系统的灭菌处理，尾气或逃液均要灭菌后才能排放，注意保持环境卫生）；2）轮换菌株（菌株轮换是工业中常用的方法，即选用另一抗噬菌体菌株进行生产或更换菌种转产其他产品，避免该噬菌体的连续污染）；3）传统的基因工程（使用传统的基因工程方法阻止噬菌体感染生产菌的各个阶段）；4）基于CRISPR－Cas系统的噬菌体防治（使用CRISPR－Cas系统进行核酸修饰从而对抗外来遗传物质的入侵［12］）。因为微生物发酵法具有生产工艺相对简单［13］、材料来源广泛、高效性、低成本［14］和低污染等优势而得到大规模的工业化应用［15］。因为现代工业发酵都倾向于大容积发酵罐并利用连续发酵工艺，所以一旦感染噬菌体将会导致发酵停止、菌体消失、发酵产物不会继续积累和发酵水平严重下降，从而造成严重的经济损失。本研究采用双层琼脂平板法从本公司感染了噬菌体的苏氨酸生车间培养液分离、纯化获得一株能高效裂解大肠杆菌MG1655的噬菌体。其噬菌斑呈圆形、大而透明、边缘整齐。电镜观察头部呈二十面体立体对称，尾部较长。酶切结果表明核酸类型为dsDNA，所以确定其属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科成员，命名为MHV4。接下来可以通过自发突变、紫外诱变以及CRISPR－Cas等方法进行抗噬菌体工程菌的筛选，预期得到生产性能不下降的抗噬菌体MHV4的生产菌株。