模拟高原缺氧环境对不同性别大鼠生理生化指标的影响

何 蕾，马慧萍，景临林，张冬梅，贾正平

高原地区由于空气稀薄，易造成初入高原人群身体不适。其中生理变化包括血氧饱和度下降，红细胞增多，血液黏稠度增加，血液流变学改变，进而影响全身组织器官[1-2]。同时由于机体氧供应不足，造成活性氧(ROS)增加，氧化应激反应可使组织损伤进一步加重，尤其对氧敏感的脑和心肌组织易损性增加[3]。高原缺氧环境严重影响高原地区建设、国防军事安全和人民身体健康。目前对高原反应预防治疗的研究越来越多，但是其机制仍不清楚。有研究表明，很多疾病的发生、发展及愈后都与性别密切相关，这种性别差异表现出不同的临床表现及愈后，但关于性别对高原缺氧耐受的影响未见报道[4]。本研究以健康Wistar大鼠为实验对象，采用低压低氧舱模拟海拔8000 m高原环境，通过比较模拟高原缺氧与正常大鼠的血液流变学、组织病理和生化指标，探讨不同缺氧时间后生理生化指标的变化情况，旨在研究低氧对机体的影响，并探讨大鼠性别与高原缺氧耐受性的关系。以期为预防和治疗高原反应提供帮助。

1 材料与方法

1.1实验仪器 MVIS 2030全自动血流变分析仪(重庆天海科技有限公司)，FLYDWC50-ⅡC低压低氧动物实验舱(贵州风雷航空军械有限公司)，BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司)，低温离心机(德国赫利氏公司)，DK-8A型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)，tissuelyser-24组织匀浆机(上海净信有限公司)，Spectra Max i3酶标仪(奥地利Molecular Devices公司)。

1.2实验动物 SPF级Wistar大鼠100只，雌雄各半，体质量(200±25)g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK2014-0020。在恒温(21～23℃)、恒湿(45%～65%)、明暗各12 h周期的饲养室，全价颗粒饲料喂养，自由进食和饮水。

1.3实验试剂 BCA法蛋白测定试剂盒(批号：20170312)，丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号：20170413)，一氧化氮(NO)测定试剂盒(批号：20170406)，一氧化氮合成酶(NOS)测定试剂盒(批号：20170306)，过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(批号：20170512)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒(批号：20170312)，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号：20170413)，Na+-K+-ATP酶活力测定试剂盒(批号：20170512)。

1.4减压缺氧损伤模型实验 将100只Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组，缺氧1、3、5和10 d组，每组20只，雌雄各10只，分笼饲养并标记。将各缺氧组放入大型低压氧舱内，以10 m/s速度升至海拔8000 m，分别停留1 d、3 d、5 d和10 d后，取出大鼠，采集动脉血，进行血液流变学指标的测定；采集大鼠脑组织和心肌组织，进行组织病理观察和生化指标测定；正常组在舱外饲养，同法处理，测定血液流变学指标，组织病理观察和生化指标测定。

1.5观察指标 ①血液流变学指标检测：各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛1 ml麻醉后，解剖腹腔，采集腹主动脉血4 ml，立即进行血液流变学分析；随后离心取上层血清，进行血清分析；测定指标包括全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数、卡松黏度、屈服应力、红细胞内黏度。②病理组织检测：取减压缺氧实验组大鼠脑和心肌组织，清洗，10%甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，染色和观察，记录实验结果。③大鼠脑组织生化指标检测：取减压缺氧实验大鼠脑组织，预冷生理盐水清洗后精密称量100 mg，按1∶10(m/v)加入4℃的生理盐水，进行组织匀浆1 min，得到10%组织匀浆液。将组织匀浆液放入低温离心机，在4℃下，3000 r/min离心10 min，离心后吸取上清液，按照试剂盒说明书操作，进行MDA、SOD、CAT、GSH-PX、NO、NOS和Na+-K+-ATP酶的测定。

2 结果

2.1血液流变学指标 与正常组比较，缺氧3、5和10 d组雌鼠全血黏度、卡松黏度和屈服应力显著升高(P<0.01)，雄鼠全血黏度、血浆黏度和屈服应力也显著升高(P<0.05，P<0.01)；其中雄鼠的全血黏度和屈服应力较雌鼠增高显著(P<0.05,P<0.01)。与正常组比较，缺氧3 d组雄鼠红细胞聚集指数显著升高(P<0.05)，缺氧10 d组雄鼠卡松黏度显著升高(P<0.05)，缺氧3和5 d组雄鼠红细胞内黏度显著降低(P<0.05，P<0.01)。而各缺氧组雌鼠血浆黏度、红细胞聚集指数和红细胞内黏度与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2大鼠脑和心肌组织病理结果 正常组大鼠脑组织结构正常，可见血管和细胞形态正常；各缺氧模型组大鼠脑组织有明显的细胞核固缩，细胞间隙明显增大，组织空泡增多，且随缺氧时间增加而愈发严重。见图1。正常组大鼠心肌组织结构正常，细胞形态完好；各缺氧模型组大鼠心肌组织细胞排列紊乱，肌纤维增粗，有炎性因子产生，肌细胞肿胀，且随缺氧时间增加而愈发严重。见图2。

2.3脑组织生化指标比较 与正常组比较，各缺氧组雌鼠和雄鼠脑组织中CAT、SOD、GSH-PX、NOS和NO均随缺氧时间延长逐渐降低(P<0.05)，且雄鼠的下降更为明显。与正常组比较，各缺氧组雌鼠和雄鼠脑组织中MDA随缺氧时间延长显著升高(P<0.05)，而Na+-K+-ATP酶在初期缺氧时显著下降(P<0.05)，第10天时恢复至正常水平，且雌鼠下降更为明显。见图3。

表1 5组大鼠的血液流变学指标比较

图1 5组大鼠脑组织病理变化(HE ×200)

图2 5组大鼠心肌组织病理变化(HE ×200)

3 讨论

高原缺氧能使体内红细胞增多，引起血液循环障碍，其中尤以血液黏度为重要变化指标[5]。血液黏度的低与高代表循环功能的优与劣或血液供应的多与少，血液黏度增加，循环阻力升高，血流速度减慢，必然导致器官和组织的血液灌流量下降，造成缺血缺氧，影响组织的代谢和功能，从而产生高原反应[6-7]。血液流变学分析是评价机体血液流动和细胞变形，血液与血管和心脏之间相互作用的主要方法。因此，通过血液流变学检测，能对高原病的发生、发展、转归以及预后提供可靠的依据。

本组实验发现，大鼠全血黏度均有显著性升高，表明缺氧会增加血液黏度，雌鼠血浆黏度无显著性变化而卡松黏度和屈服应力有显著升高，其原因可能是由红细胞增多及变形引起的[8]；而雄鼠血浆黏度、卡松黏度和屈服应力均有显著升高，表明除红细胞增多及变形外血浆蛋白和血脂可能升高[9]。雄鼠血液黏度比雌鼠升高更明显，可能与激素水平有差异相关。因此，对高原缺氧人群及时及早发现在血液流变学异常的可逆阶段，并及时降低血液黏稠度，减少红细胞，可以逆转此过程，阻止疾病进一步发展，对男性而言尤其重要。

脑和心肌组织是对氧最为敏感的两大器官，本实验HE染色结果显示，正常大鼠脑和心肌组织结构正常，无明显病理改变。而各缺氧组大鼠的脑组织有明显的细胞核固缩，细胞间隙明显增大，组织空泡增多；心肌组织疏松水肿，血管扩张，毛细血管增多，炎性细胞浸润。均随缺氧时间增加而愈发严重。表明高原缺氧会造成组织病理学改变，损伤机体器官功能。

在高原缺氧的发生发展过程中，氧化应激和能量代谢的作用至关重要。机体在高原缺氧条件下产生大量ROS，ROS能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，形成脂质过氧化物MDA，具有细胞毒性，能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡[10-11]。MDA含量可反映体内脂质过氧化反应程度，间接提示细胞损伤程度。而SOD和CAT是体内天然存在的自由基清除物质，对氧化与抗氧化平衡起至关重要的作用。GSH-PX能特异性催化GSH对氢氧化物的还原反应，其活力的升高有利于机体清除ROS和保护机体组织细胞结构和功能的完整性[12-14]。结合实验结果，各缺氧组大鼠脑组织中MDA含量随着缺氧时间的延长显著增加，SOD、CAT、GSH-PX水平随着缺氧时间的延长均明显降低。表明高原缺氧使抗氧化酶活力降低，脂质过氧化反应增加，机体氧化与抗氧化平衡受到破坏，导致细胞膜基本结构改变，进一步影响细胞功能，致使细胞损伤甚至死亡，从而破坏脑组织功能，影响认知。

机体的主要能量供应是ATP，在高原缺氧环境下，体内ATP含量降低，造成能量供应不足，引发疲劳感[15]。NO是血管内皮舒张因子，NOS是NO合成的限速酶。低氧时脑组织产生强烈的脂质过氧化反应，降低NOS活性，同时NO的合成和释放减少，最终导致血管收缩增强，脑动脉压升高[16]。本实验结果显示，在缺氧条件下，Na+-K+-ATP酶活性先降低后恢复，其中雌鼠较雄鼠降低更明显，可能与激素有关；NO含量和NOS活力均有显著性下降，且雄鼠下降更加明显，表明雄鼠可能血管收缩更为显著，出现高原头痛症状的可能性更大。

综上所述，高原缺氧可引起脑和心肌组织损伤，可能是由血液黏稠和氧化应激反应引起的。且雌鼠和雄鼠在指标上具有一定差异，这可能与雌激素具有扩张血管、抗炎、抗氧化的作用有关。其具体损伤机制有待于进一步深入研究。