益气养阴祛瘀方药对特发性肺纤维化大鼠氧化损伤的影响

支 政，邱 刚，赵 静，方 芳，杨丽芸，方朝义

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)发病原因复杂，病变以弥漫性肺泡炎、肺纤维化为主。其常见临床表现为进行性呼吸困难，活动后加重，常伴有咳嗽、胸闷等症状。IPF好发于中老年人群，预后较差，5年生存率为30%～50%，且其发病率和病死率逐年升高。而目前IPF的发病机制尚未明确，临床上缺少有效的治疗手段，给患者生命健康造成严重威胁[1-4]。从中医的角度而言IPF属于“肺痿”范畴，结合古代医家对肺痿的认识，“肺虚络瘀”是IPF的核心病机[5-6]。故本研究以益气养阴祛瘀为治法组方，探究IPF对机体所造成氧化损伤的特征以及益气养阴祛瘀方药的作用机理，为临床上中医药治疗IPF奠定理论基础，现将具体内容报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级wistar大鼠135只，雌雄各半，体质量(200±20)g，鼠龄10～12周，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，合格证号：0015045，许可证号：SCXK(鄂)2004-2007。

1.2药品和试剂 博来霉素(日本化药株式会社，进口许可证号：X20000349)；醋酸泼尼松片(河南永和制药公司，批号：H41024247)。益气养阴祛瘀方药：黄芪、麦冬、丹参、银杏、太子参、百合、地龙、虎杖，按照3∶1.5∶1.8∶1∶1.5∶1∶1∶1.5的比例，调配成药，常规水煎。丙二醛(MDA)检测试剂盒(20051211)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(20051209)均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3主要仪器与设备 AE200电子分析天平(梅特勒-多利托仪器上海有限公司)，TDL-5A型离心机、MSE-25型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，LEICARMZ135石蜡切片机(德国莱卡公司)，SFC-182型生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)，GL-88B型旋涡混匀器(江苏海门其林医用仪器厂)，电动匀浆器(52954部队电器厂)，WD4060超低温冰箱(冠森生物科技上海公司)，HH-W21-cr600电热恒温水箱(北京长安科学仪器)。

1.4分组及给药 将135只Wistar大鼠常规饲养3 d后，称重，并根据体质量随机分为对照组、模型组、高剂量组、低剂量组和强的松组，各27只。造模后第2天给予对照组和模型组生理盐水10 ml/kg灌胃，高剂量组和低剂量组分别给予等量的2.46 g/ml和1.23 g/ml益气养阴祛瘀方药混悬液灌胃，强的松组给予等量的0.6 mg/ml强的松灌胃，均为每日1次。每组大鼠又根据给药时间不同分为3个亚组，每组9只，分别于给药7 d、14 d和28 d时处死大鼠进行观察。

1.5造模方法 按照参考文献[7-9]的方法复制IPF大鼠模型，腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg，待大鼠麻醉后，固定于30°倾斜鼠板，将7号无菌针头插入气管，插管成功后，对照组给予气管内滴注生理盐水5 ml/kg，模型组、高剂量组、低剂量组、强的松组大鼠气管内滴注博来霉素0.2 ml(按体质量5 mg/kg给药)，滴注完毕后将大鼠直立，左右旋转约1 min，使药液均匀分布于双肺，完毕后缝合皮肤，待大鼠自然清醒后进行常规饲养。

1.6观察指标及检测方法 ①一般情况：每日观察各组大鼠饮食状态、呼吸情况、活动力、反应灵敏度、皮毛光泽度等。②MDA含量和SOD活力检测：分别选取各组大鼠血清和肺组织，利用硫代巴比妥酸比色法测定MDA，利用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。③肺组织病理改变：各组大鼠麻醉后，取右叶肺组织，经4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm切片，常规HE、Masson染色，在光镜下观察。

2 结果

2.1一般情况 对照组大鼠饮食如常，毛发光亮，反应灵敏，呼吸平稳，体质量呈上升趋势。模型组大鼠出现呼吸困难，食欲不振，反应迟钝，身体蜷曲，大便干燥，小便量少，皮毛枯槁，多呈倒竖状。高剂量组与低剂量组大鼠状态随着时间的增加逐渐好转，活动弱于对照组而强于模型组，饮食逐渐恢复，皮毛光亮，呼吸平稳。强的松组大鼠状态随时间增加亦呈现好转趋势。给药7 d的低剂量组和强的松组各死亡1只，给药14 d的模型组、高剂量组、低剂量组和强的松组各死亡1只，给药28 d的模型组和高剂量组各死亡2只，给药28 d的低剂量组和强的松组各死亡1只。

2.2血清和肺组织的MDA含量比较 给药7、14和28 d，模型组的血清和肺组织MDA含量均高于对照组(P<0.05)，高剂量组和强的松组的血清MDA含量均低于模型组(P<0.05)，高剂量组的肺组织MDA含量低于模型组(P<0.05)。给药7和28 d，低剂量组和强的松组肺组织的MDA含量低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清和肺组织的丙二醛含量比较

2.3血清和肺组织的SOD活力比较 给药7、14和28 d，模型组的血清SOD活力低于对照组(P<0.05)，高剂量组高于模型组(P<0.05)。给药14和28 d，低剂量组的血清SOD活力高于模型组(P<0.05)，高剂量组高于强的松组(P<0.05)。给药7 d，强的松组的血清SOD活力高于模型组(P<0.05)。给药28 d，低剂量组的血清SOD活力高于强的松组(P<0.05)。给药7和14 d，模型组的肺组织SOD活力低于对照组(P<0.05)，高剂量组、低剂量组和强的松组高于模型组(P<0.05)。给药14 d，高剂量组的肺组织SOD活力高于强的松组(P<0.05)。见表2。

2.4肺组织外观形态变化 对照组双肺组织结构清晰，表面光滑、色红、具有良好弹性。模型组给药7 d时双肺可见散在出血点，出现灶状瘀斑，体积增大；给药14 d时双肺边缘有点状出血，色灰白，局部见不同程度的结节样改变，部分肺叶体积缩小；给药28 d时双肺色苍白，质地变硬，弹性降低。高剂量组、低剂量组及强的松组双肺色暗红，局部体积缩小，可见不同程度的结节样改变，偶见散在出血点。

2.5肺组织病理变化 对照组双肺结构清晰，未出现炎症及水肿现象，给药7、14和28 d时均未见病理改变。模型组给药7 d时肺泡间隔增宽，肺间质弥漫性炎性细胞浸润；给药14 d时肺间质炎性细胞浸润程度降低，肺泡间隔明显增宽增厚，成纤维细胞增生；给药28 d时肺纤维化程度严重，肺泡结构萎缩甚至消失。高、低剂量组及强地松组肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润程度低于模型组，成纤维细胞少量增殖。其中高剂量组炎性细胞浸润及肺纤维化程度最轻。见图1～4。

表2 各组大鼠血清和肺组织的超氧化歧化酶活力比较

图1 各组大鼠给药14 d的肺组织形态学改变(HE ×100)

图2 各组大鼠给药14 d的肺组织形态学改变(HE ×400)

图3 各组大鼠给药28 d的肺组织形态学改变(Masson ×100)

3 讨论

IPF的发病机制尚未明确，其主要病理改变为肺纤维化，危害严重，最终可导致患者因呼吸衰竭而死亡[10-11]。IPF的发病率逐年升高，且预后情况较差，给患者的生命健康造成严重威胁[12-13]。临床常应用抗生素及免疫抑制剂治疗IPF，而治疗效果并不明显[14-15]。近年来，许多中医临床研究者认为“血瘀内阻”为形成肺痿的核心，利用益气养阴祛瘀方药治疗IPF取得了一定的效果[16-18]。但仍缺乏系统的研究，故本研究旨在探讨IPF状态下机体氧化损伤的特点和益气养阴祛瘀方药的作用机理。

受到良好控制的自由基会维持机体的生命活力，然而自由基失去控制后，会对机体造成不良影响。研究表明，自由基损伤存在于多种疾病过程中，机体经酶系统和非酶系统产生氧自由基，而氧自由基具有过氧化杀伤作用，可形成酮基、羟基等多种脂质过氧化物，过多的氧自由基会导致多种疾病发生。MDA是氧自由基在生物膜中攻击多不饱和脂肪酸所形成的最终产物，会导致生物体内的大分子物质如蛋白质、核酸聚合，且具有细胞毒性。故可通过测定MDA含量的变化评价机体脂质过氧化的程度，从而了解组织细胞氧化损伤程度。MDA含量越高，表明机体脂质过氧化程度越高，病情越严重。本研究模型组血清和肺组织MDA含量显著高于对照组。说明机体脂质过氧化程度增加，导致清除过量氧自由基能力减弱，机体耗氧量显著增加，产生大量氧自由基。脂质过氧化程度的增加导致MDA含量的升高，提示氧化损伤在IPF的发生发展过程中起重要作用。

SOD是存在于人体正常组织中可清除氧自由基的酶系统，具有抗衰老的作用[19]。SOD活性越高，清除氧自由基的能力就越强，故SOD活力水平可反映机体抗氧化能力的强弱。IPF大鼠前期SOD功能受到抑制，肺脏为自我保护从而消耗SOD，本实验中模型组给药7和14 d时肺组织中SOD活力水平明显低于对照组验证了这一观点。本研究发现，益气养阴祛瘀方药对提高SOD活力水平起到了促进作用，具有降低脂质过氧化反应，减轻氧自由基损伤从而保护肺组织的作用。

综上所述，益气养阴祛瘀方药具有降低MDA含量，提高SOD活力水平，降低脂质过氧化反应的作用。故益气养阴祛瘀方药可有效减轻肺组织氧化损伤及肺纤维化程度，在临床IPF的治疗方面发挥重要作用。