Tlr4基因敲除小鼠生长和繁殖的实验研究

郑 洋，王佳慧，刘露露，黎桂玉，彭 岳，赵铁建*

(1.研究生学院；2.基础医学院；广西中医药大学, 南宁 530001)

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类天然免疫受体，能引发一系列信号转导，导致炎性介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用[1]。其中TLR4是人类发现的第一个TLRs相关蛋白，革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是其主要配体[2-3]。近年研究发现，TLR4表达于各类肝脏细胞中，可以调节肝脏细胞的天然免疫反应，参与肝脏的病理生理过程，在肝脏疾病的发生发展中发挥重要作用[4]。为了深入研究肝纤维化的发病机制，本课题组购买了Tlr4基因敲除的小鼠，在造肝纤维化模型前的饲养阶段，研究人员发现Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠在生长和繁殖方面具有一些差异，所以本文将两种小鼠进行比较，为研究Tlr4基因在肝纤维化形成过程中的作用，提供更加完整详细的实验数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级Tlr4基因敲除小鼠20只，雌雄各半，2周龄，体重4～10 g，购买于南京大学-南京生物医药研究院，种系为C57BL/10ScNJNj，合格证号[SCXK(苏)2015-0001]，清洁级KM小鼠20只，雌雄各半，2周龄，体重10～15 g，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号[SCXK(湘)2016-0002]。使用许可证号[SYXK(桂)2015-0001]。按照实验动物使用的3R原则予以人道关怀。

按照清洁级动物的环境要求饲养两个小鼠品系，环境中温度25℃左右，相对湿度控制在30%～60%，小鼠笼和饮水瓶每3 d用84消毒液和75%酒精消毒一次，鼠笼的垫料、饲料、水均经灭菌处理，垫料3 d更换一次。两个小鼠品系均采用一雌一雄同笼进行繁殖。

1.2 主要仪器

电子天平HLD-10001(四川中浪科技有限公司)，最大称重重量为1000 g，精度为0.1 g。卡尺A635051(上海艾测电子科技有限公司)，范围为0～150 mm，分辨率为0.05 mm。

1.3 实验方法

在周龄刚好达到时测量体重和体长。体长指双耳连线的中点到尾体交接处，体长测量需借助于不锈钢网，当小鼠在网上抓紧时，拉住它的尾巴使其自然伸直，然后进行测量。增长率=(体重或体长-第2周的体重或体长)/第2周的体重或体长。从第4周开始一直测量到12周结束，因为小鼠的哺乳期约为3周，在6周龄的时候是性成熟的时间段，所以选择快速进展期的小鼠进行测量。繁殖能力的测量对象是一雄一雌所产的第2胎的幼仔数量，可代表繁殖能力[5-6]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠生长的比较

2.1.1 小鼠体重及其增长率的比较

Tlr4基因敲除小鼠体重及其增长率明显小于KM小鼠，从第4周到第12周差异显著(P< 0.05)，详细见表1～2。

2.1.2 小鼠体长及其增长率的比较

在第4周和第5周两者相比差异不明显，P> 0.05；在其它的时间段，Tlr4基因敲除小鼠体长及其增长率明显小于KM小鼠，P< 0.05。具体见表3～4。

表1 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠体重比较(g, n=20)Table 1 Comparison of the body weight of Tlr4 knockout mice and KM mice

注：两者相比差异显著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表2 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠体重增长率比较(%，n=20)Table 2 Comparison of the body weight growth rates between Tlr4 knockout mice and KM mice

注：两者相比差异显著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

2.2 小鼠繁殖能力的比较

在Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠的群体中，随机选取20笼一雄一雌合笼的小鼠为研究对象，统计其第2胎所产的幼仔个数，具体见表5，Tlr4基因敲除小鼠繁殖能力明显小于KM小鼠，P< 0.05。

3 讨论

本课题组用Tlr4基因敲除小鼠制备肝纤维化模型，研究Tlr4如何通过NF-KB、MARKs两条信号通路在肝脏炎症反应中发挥作用，Tlr4基因敲除小鼠成本高昂，而在制备肝纤维化模型过程造中，小鼠死亡率较高，因此如何更好的饲养以及将基因敲除小鼠品系保存下去，具有十分重要的意义。本研究发现Tlr4基因敲除小鼠在生长和繁殖均弱于正常KM小鼠,而Tlr4已经证实和多种疾病的发生相关，例如肝纤维化，如果研究Tlr4和肝纤维化之间的关系，Tlr4基因敲除小鼠则是理想的动物模型，因为Tlr4通过MyD88调控NF-κB、MAPKs两条信号通路[7]，当Tlr4基因被敲除后，这两条通路的信号传导被阻断，通过对信号通路中的关键分子检测，可以得到疾病相关的分子机制，以及Tlr4和肝纤维化之间的关系。所以正确的饲养，对于Tlr4基因敲除小鼠的获得和保种十分重要。在饲养Tlr4基因敲除小鼠的过程中，报告发现有食子的现象，有研究表明很多基因敲除小鼠都有食子现象[8]，根据李巍[9]的饲养方法进行改良，减少每天观察小鼠的次数，这样可以减少对小鼠的惊吓，给予花生米、葵花籽以及熟鸡蛋黄发现食子现象得到很好的缓解，另Tlr4基因敲除的小鼠比KM小鼠对环境的要求更高，在饲养过程中，如果消毒不及时或者对饲养环境的卫生处理不得当，基因敲除小鼠会出现死亡的现象，笔者认为这可能和其Tlr4基因敲除，使其免疫力下降有关，有研究表明TLR4与免疫力的关系密切[10]。TLR4是TLR4信号通路中的关键分子也可以调控NF-κB、MAPKs信号通路，这些信号通路都是炎性通路。有研究表明[11]，发生炎性疾病时，使用药物抑制TLR4表达后疾病的严重程度下降。但当敲除Tlr4基因后，免疫细胞表面没有TLR4的表达，TLR4与病原体的结合受到阻碍，将影响机体的适应性免疫应答[12]。所以Tlr4基因敲除后会对小鼠的生长产生很大的影响。

表3 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠体长比较(cm, n=20)Table 3 Comparison of the body length of Tlr4 knockout mice and KM mice

注：两者相比差异显著，*P< 0.05。

Note.There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表4 Tlr4基因敲除小鼠和KM小鼠体长增长率比较(%，n=20)Table 4 Comparison of body length growth rates between the Tlr4 knockout mice and km mice

注：两者相比差异显著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

表5 Tlr4基因敲除小鼠与KM小鼠繁殖能力(幼仔个数)比较Table 5 Reproductive performance(number of cubs)of the Tlr4 knockout mice and KM mice

注：两者相比差异显著，*P< 0.05。

Note. There were significant differences between the two,*P< 0.05.

本研究发现Tlr4基因敲除对小鼠生长和繁殖的影响，在体重和其增长率上Tlr4基因敲除小鼠明显小于KM小鼠，在体长和其增长率上在第4周和第5周时，两个小鼠品系差异不明显，在其它的时间段Tlr4基因敲除小鼠明显小于KM小鼠，在繁殖上Tlr4基因敲除小鼠明显弱于KM小鼠。