复方鱼腥草胶囊中连翘苷和黄芩苷的高效液相色谱法含量检测

周宝玉 虞文妹

(南京中医药大学附属常州市武进中医医院中药房，南京，213161)

复方鱼腥草胶囊是近年来《中华人民共和国药典》新增加的中药复方制剂，临床生产和使用量较大，有多家厂家获得复方鱼腥草胶囊的生产批准文号，复方鱼腥草胶囊的主要药物组成及比例为鱼腥20：草板蓝根5：黄芩5：连翘2：金银花2，该方主要用于治疗具有风热证候表现，因外感风热而起咽喉疼痛、急性扁桃体炎、急性咽炎等病症，全方以鱼腥草为君药清热解毒，以黄芩、板蓝根为臣药，清热泻火、燥湿凉血、解毒利咽，以连翘和金银花为佐使，助君臣清散风热，凉血解毒之功[1-2]。目前关于复方鱼腥草胶囊的文献报道较少，有研究显示高效液相色谱法(HPLC)分析发现鱼腥草中药理活性较多[3-4]，有研究复方鱼腥草合剂中薄层色谱法(TLC)研究金银花的主要成分绿原酸并测定其含量[5]，然对该方中主要药物的连翘和黄芩，目前的报道研究较少，基于此，本课题组以测定连翘苷和黄芩苷为主要研究指标，检测复方鱼腥草胶囊中二者的含量，以满足患者不同服药需求，现将复方鱼腥草胶囊HPLC研究详细报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 沃特世高效液相色谱仪2695，沃谱达仪器(苏州)有限公司);外校电子精密天平(梅特勒ML802，苏上海精学科学仪器有限公司);TQC薄层板涂布器(VF2161，上海诺彩贸易有限公司)

1.2 试剂 色谱HPLC甲醇，色谱HPLC冰醋酸、色谱HPLC乙腈、色谱HPLC磷酸和色谱HPLC无水乙醇均购于上海展云化工有限公司;中国食品药品检定研究院提供的超纯水、连翘苷对照品(批号-110821-201514)和黄芩苷对照品(批号-0715-9909)。

1.3 分析样品 随机选取2个不同厂家生产的样品1：复方鱼腥草胶囊(云南云龙制药股份有限公司，国药准字Z20055662)；样品2：复方鱼腥草胶囊(安徽威尔曼制药，国药准字Z20050708)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用ACQUITY-BEHP-henyl-C18保护柱(5 μm)，以室内温度为柱温，进样量为20 μL以乙腈为流动相A，以水+0.02%磷酸为流动相B，流速1.0 mL/min：检测波长为327 nm。

2.2 对照品溶液的制备 首先将连翘苷对照品、黄芩苷对照品放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分别精密称取10.3、5.3 mg于50 mL量瓶中，连翘苷对照品瓶加入50%甲醇适量，黄芩苷对照品瓶加入无水乙醇适量，均超声溶解，混合均匀后制成连翘苷对照品溶液(0.206 mg/mL)和黄芩苷对照品溶液(含黄芩苷0.106 mg/mL)。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取复方鱼腥草胶囊的内容物3.0 g于20 mL的锥形瓶中并加入适量甲醇，采用软木塞塞紧瓶口，充分混合均匀后记录重量，超声处理(功率500 W)30 min后，待溶液冷区后记录重量，比较2次重量，计算重量差并以甲醇补齐至等重，采用0.45 μm微孔滤膜过滤混合液制成供试品溶液。

2.4 专属性试验 取同一供试品溶液根据2.3制备的供试品溶液，采用HPLC对复方鱼腥草胶囊中连翘、黄芩等进行专属性试验，结果显示如图1和图2，复方鱼腥草胶囊中连翘和黄芩专属性良好。

图1 连翘专属性试验HPLC色谱图

图2 黄芩专属性试验HPLC色谱图

2.5 线性关系考察 分别精密量取连翘苷、黄芩苷对照品的甲醇溶液3.0、6.0、12.0、18.0、24.0 mL，分别置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀后分别精密吸取10 μL，采用HPLC，记录峰面积；以对照品进样量(μ g)为横坐标(X，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，连翘苷回归方程Y=98 009X-86650，r=0.999 2(n=5)，结果表明，连翘苷对照品在3.23～103.02 μg/mL范围内线性关系良好；黄芩苷回归方程Y=212 284X+108 806，r=0.999 8(n=5)，结果表明，黄芩苷对照品在2.74～87.89 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 中间精密度试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，连续进样5次，结果显示相对标注偏差RSD是1.13%，精度度良好。

2.7 供试品溶液稳定性试验 在室温下精密吸取10 μL同一供试品溶液，配置后分别放置0、1、4、8、10、12、24 h后进样检测，结果显示24 h内供试品溶液基本稳定，RSD是1.35%。

2.8 重复性试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，在相同色谱条件，相同液相分析仪上检测5次，结果显示标准偏差RSD为1.20%，重复性良好。

2.9 回收率试验 采用加样回收法，精密称取5份已知含量的同一批号样品各约0.5 g，分别精密加入20 mL混合对照品甲醇溶液(0.005 36 mg/mL)，进行回收率试验测定，计算结果显示平均回收率为99.07%，RSD为0.75%。见表1和表2。

表1 连翘苷回收率试验测定结果

表2 黄芩苷回收率试验测定结果

2.10 样品测定结果

2.10.1 薄层色谱法鉴别连翘苷和黄芩苷 将制成的对照品和供试品溶液分别吸取5 μL滴于硅胶G薄层板上，在展开剂23醋酸丁酯:8甲酸:7水的作用下，经365 nm的紫外灯观察发现连翘苷和黄芩苷在阴性对照品位置上相互之间不存在干扰现象。见图3。

图3 复方鱼腥草胶囊中连翘苷和黄芩苷的鉴别

注：1.金银花、鱼腥草双阴性对照品，2.黄芩阴性对照品，3～5复方鱼腥草胶囊，6.连翘苷，7.黄芩苷

2.10.2 高效液相色谱分析连翘苷和黄芩苷含量 在每批样品做3次重复研究取平均值后，结果显示2个样品中连翘苷和黄芩苷的含量和RSD值均差不多，具体数值如表3所示。

表3 复方鱼腥草胶囊中连翘苷和黄芩苷含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相的优化 在分离连翘药材中的连翘苷和黄芩药材中的黄芩苷的HPLC研究中，实验室流动相优化研究中，分别以水-甲醇、水-乙腈，乙腈-0.01%磷酸，乙腈-0.02%磷酸，乙腈-0.03%磷酸等不同的流动相进行分离，经过反复数次的研究后，发现室内温度为柱温，进样量为20 μL时，以乙腈为流动相A，以水+0.02%磷酸为流动相B，流速1.0 mL/min：连翘苷和黄芩苷的分离度最大，能够满足后续研究中连翘苷和黄芩苷的定量测定，由此本研究最终选择的流动相是乙腈-0.02%磷酸。

3.2 专属性试验的重要性 本研究复方鱼腥草胶囊由五味药组成，制订了HPLC色谱法鉴别研究其专属性进行定性质量评价；本研究的目的是检查复方鱼腥草胶囊中连翘苷和黄芩苷的含量，而复方鱼腥草胶囊药味多，药性复杂，在有其他成分存在的可能情况下，如果连翘苷和黄芩苷这2个需要检测的成分不具有专属性，那么在后续的含量检测中则可能因为杂质的影响而造成偏差。假如在专属性试验中发现含有杂质，那么在杂质可获得的情况下，可以采用加入杂质到待测样品于未加入杂志的待测样品进行比较，考察杂质对目标成分含量测定是否存在干扰性[6-8]。基于前期研究条件如精密度、重复性、稳定性、线性考察和样品回收率等方法的反复试验调整了最佳HPLC色谱条件，显示多元指纹图谱是一种方法简便，且具有高灵敏度、高重复性和较强的专属性强的一种研究方法[9-12]；本研究结果HPLC色谱图显示复方鱼腥草胶囊中连翘苷和黄芩苷的专属性良好。

3.3 薄层色谱法与HPLC结合进行复方鱼腥草胶囊含量检测的意义 薄层色谱法(TLC)以涂布于硅胶板、玻璃板等支持剂上作为固定相并形成一个均匀的薄层，加入合适的展开剂作为其流动相，对样品具有分离、鉴别和定量的功能[13-17]，由于TLC对生物高分子的分离效果不够理想[18-19]，因此在定量性研究中，目前的主流研究方法是采用HPLC进行[20-21]，本研究采用TLC与HPLC 2种方法相结合的方式，对复方鱼腥草胶囊中连翘苷和黄芩苷进行含量检测。复方鱼腥草胶囊的清热解毒功效好，它是植根于深厚的中医药传统理论基础，同时结合丰富的临床实践经验而被研发出来的中药复方制剂，在当今存在“抗生素类药物滥用”的情况下，《中华人民共和国药典》收录复方鱼腥草胶囊的这一举措，关注及肯定复方鱼腥草胶囊在临床的广泛适用性和部分替代抗生素的治疗价值的。研究中为控制复方鱼腥草胶囊的药物质量的安全性，在对连翘苷和黄芩苷含量检测之前，首先采用薄层色谱法结合处方药味所含化学成分及药理学活性，对连翘中的连翘苷、黄芩中的黄芩苷等进行了定性鉴别，研究结果显示3批不同的测试样本的色谱斑点清晰，重现性好，空白均无出现干扰；接着应用多元指纹图谱分析测定了复方鱼腥草胶囊制剂中连翘苷、黄芩苷的含量，本研究结果显示样品1连翘苷含量0.51 mg，RSD为1.72%，黄芩苷含量14.6 mg，RSD为4.95%；而样品2连翘苷0.50 mg，RSD为1.69%，黄芩苷含量14.3 mg，RSD为4.92%；2组复方鱼腥草胶囊样品中连翘苷和黄芩苷的含量差异无统计学意义。