中药饮片中真菌毒素前处理方法进展

董姣姣 范妙璇 陈炼明 傅欣彤 肖红斌

(1 北京中医药大学,北京，100102; 2 北京市药品检验所,北京,100035)

真菌毒素残留是中药材微量外源性有毒有害物质的残留，是目前该领域研究的热点。各国政府对真菌毒素的分布及检测予以了极大的关注，特别是欧洲、韩国等国家对此设定了严格的限量规定，但发现各国更侧重对食品中真菌毒素进行限量规定，对药材真菌毒素规定较少，见表1。2015年版《中华人民共和国药典》规定陈皮、僵香、胖大海、酸枣仁、桃仁等19味药材需要检测黄曲霉毒素，其中B1不得超过5 μg/kg，B1、B2、G1、G2总量不得超过10 μg/kg，且规定其净化方式为免疫亲和柱净化法，但并未对其余中药材及真菌毒素进行限量规定。真菌毒素种类繁杂，且在不同种类和不同基质中药之间都存在着很大的差异，使检测难度增大。其前处理方法的好坏在很大程度上决定了检测结果的准确性，因此为了提高检测结果的准确性，研究不同的基质的中药和不同的毒素的前处理方法尤为重要。

1 分类综述

1.1 提取方法

表1 各国对真菌毒素的限量标准

一种好的提取方法不仅要求提取充分，而且要求提取的物质中含有尽量少的非目标组分，这将有利于之后毒素的分离和纯化。真菌毒素寄生在中药基质的各个角落，需要外界力量使其溶解。目前常用的毒素提取溶剂包括甲醇、乙酸乙酯、乙腈和水中的一种或多种不同配比的混合物，提取方法主要有高速均质提取法、振荡提取法、超声提取法、高速搅拌提取法等[5]。

1.1.1 高速均质提取法 高速均质提取法，是在提取剂环境中利用均质机器将样品进行高速旋转，使提取剂与样品组织进行充分接触，进而将中药材中的真菌毒素提取出来。不足之处在于此种方法由于高速搅拌可能破坏分子结构。韩铮等[6]选取不同基质的30份中药材，包括根茎类(白芍、丹参等)、种子果实类(酸枣仁、苦杏仁等)、花类(菊花、槐花等)、全草类(大青叶、青黛等)，通过比较甲醇、乙腈、水、甲醇/水(84/16,v/v)、甲醇/水(50/50,v/V)、乙腈/水(84/16,v/v)、乙腈/0.1 M的碳酸钠水溶液(70/30,v/v)、乙酸乙酯等溶液对中药材真菌毒素的提取率，分别选择86%乙腈提取AF类真菌毒素、乙酸乙酯提取OT类真菌毒素、50%乙腈提取FB类真菌毒素，乙腈加氯化钠提取ZEN，并经UPLC/MS/MS分别测定。Katerere D R等[7]在薯蓣属、灵芝属类等植物中加入氯化钠，用80%甲醇对其进行高速均质提取，得到AFB1、FB1、FB2、FB3结果。Zheng H等[8]则用84%乙腈水对根茎、花类、种子类和全草类的不同中药进行高速均质提取，测定了AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2六种AF类真菌毒素结果。Han Z等[9]比较了不同浓度的甲醇水和乙腈水对柑橘、柴胡等中药材中DON、3-ADON、15-ADON、NIV和Fus X的提取率，选择用84%乙腈水作为提取溶剂，对其进行高速均质提取。Liu X等[10]比较了50%甲醇水、50%乙腈水、75%甲醇水、75%乙腈水、1%甲酸乙腈水和1%甲酸甲醇水对桃仁、酸枣仁、当归等中药中FB1、FB2、FB3的提取效果，发现用50%乙腈水提取同时，使用NaOH调节PH为6～9，将达到符合要求的回收率。Zhang L等[11]将氯化钠加入北五味子、山楂等中药材粉末后加入70%甲醇高速均质提取过滤，后加入磷酸缓冲盐调节PH为7.8并用2%吐温-20助溶，得到待净化溶液。Arroyo-Manzanares N等[12]将水飞蓟研磨，加入磷酸缓冲盐、5%甲酸乙腈涡旋高速均质提取AF、NIV等真菌毒素。朱禹澎[39]等对比了药典甲醇提取法和不同的离心速度对黄曲霉提取的影响，选择提取溶剂为70%甲醇对陈皮粉末加入氯化钠高速均质提取，并将离心速度由2500 r/min改为4 000 r/min，发现此方法对进液相的峰有所改进。

1.1.2 振荡提取法 振荡提取是一种较常见的提取方法，优点在于将样本混合均匀会大幅度增加液体的流动性，从而提高提取效率，且不会损坏样本，但对不同基质的中药真菌毒素的提取率差别较大。孔祥虹等[14]加氯化钠于样品中，用乙腈直接振荡提取生姜、槐花等植物中的黄曲霉毒素，并用玻璃纤维过滤。Zheng R等[15]用84%乙腈水对太子参、苦杏仁等244批样品振摇提取，通过LC-MS/MS检测到AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA和ST六种真菌毒素，回收率在91.2%～112.1%之间。林方芬等[16]用84%乙腈水对川贝母、杜仲等15种药材涡旋振荡提取后吸取上清液60 ℃蒸干复溶得供试液。Zheng R S[17]等用乙酸乙酯直接涡旋提取金银花、厚朴等中药得到AFB1、B2、G1、G2、OTA、ST 6种真菌毒素，并分别用形态学、分子式识别、液质连用等方法鉴别。 Ali N等[18]选择70%甲醇水振荡提取槟榔得上清液，用吐温-20：PBS(1∶ 9)助溶，再通过玻璃纤维纸过滤，得到澄清的提取液。付成平等[19]直接用80%甲醇振荡提取穿山龙中的AFB1，且未经过其他提取操作。

1.1.3 超声提取法 超声提取法利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率，但其破碎力较强，杂质溶出较多。陈重均[20]考察了70%甲醇、100%甲醇、84%乙腈及100%乙腈对黄芪中真菌的提取效率，最终使用100%乙腈对黄芪中10种真菌毒素超声提取。李峻媛[21]比较了乙腈-水(84∶ 16，v/v)和甲醇-水(80∶ 20，v/v)对薏苡仁中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素的提取率，选择了乙腈-水(84∶ 16，v/v)超声提取作为其提取方式，并经过滤纸过滤。万丽等[22]使用70%甲醇超声提取川芎、柏子仁等14批中药中的黄曲霉毒素，玻璃纤维过滤。赵连华等[23]以80%甲醇水超声提取后滤过玻璃纤维纸，取2 mL N2吹干，50%甲醇复溶得AF类4种黄曲霉毒素。李梦华等[24]对比了甲醇-水(80∶ 20，v/v)与甲醇-水-0.1甲酸(79∶ 20∶ 1，v/v/v)对8种毒素的提取率，发现甲醇-水(80∶ 20，v/v)体系对伏马毒素的回收率在60%左右，而甲醇-水-0.1甲酸体系使伏马毒素的回收率达到80%以上，故选择甲醇-水-0.1甲酸对山药中的AFB1、B2、G1、G2、OTA、FB1、FB2、ZEA 8种真菌毒素超声提取。胡一晨等[25]使用80%甲醇超声提取川芎、白芷、半夏等5种中药中的黄曲霉毒素。朱迪[26]通过加入氯化钠并用70%甲醇对87批中药饮片超声提取，检测4种AF类真菌毒素。Kong W J等[27]比较了不同浓度的甲醇水和乙腈水对薏苡仁中AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、β-ZOL、α-ZOL、ZON的提取率，并对比了加入氯化钠和不加氯化钠的区别，选择了80%甲醇加入氯化钠超声提取。Yang L等[28]使用80%甲醇超声提取甘草、黄芪、黄芩等中药中的OTA后加入3%吐温-20溶液助溶。郝爱鱼等[29]通过70%甲醇超声提取120批中药饮片后加入10%吐温-20溶液助溶得4种AF类真菌毒素。Wei R等[30]比较了不同浓度的乙腈和甲醇对AFB1、B2、G1、G2、OTA的提取率，发现80%甲醇的提取可以达到符合要求的回收率。故选择80%甲醇对甘草中此5种真菌毒素进行提取并加入2%吐温-20溶液助溶得。曹纪亮[31]比较了80%甲醇超声提取20 min和振摇提取60 min的提取率，发现无明显差异，选择较为简便的80%甲醇对中药鸦胆子、生姜中的黄曲霉及赭曲霉进行提取。并且，曹纪亮等还考察了不同浓度的吐温-20/PBS溶液对沉淀的助溶效果，发现2.0%的吐温-20/PBS溶液能有效抑制沉淀的产生。通过测定后发现赭曲霉污染较为严重，故建立了赭曲霉的提取方法为60%乙腈水超声提取滤过后，加水稀释盐酸调节PH为1.0。YangYing等[32]将氯化钠与生姜混合后加入80%甲醇水超声提取，在过滤前先加入2% 吐温-20/PBS混匀滤过玻璃纤维纸得供试液。韦日伟等[33]将甘草粉碎加入氯化钠用80%甲醇超声提取后定量滤纸粗滤之后加入2%吐温-20稀释。Wen J等[34]用同样的方法提取测定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA 5种真菌毒素。李春等[35]先将何首乌粉末中加入水、1%乙酸乙腈溶液涡旋，后超声提取，离心，吸取上清液备用。

1.1.4 搅拌提取 搅拌提取法是在样本浸渍提取的基础上加快物质的溶出，操作简单易行，使用搅拌机等简易仪器即可完成，但提取耗时较长。王少敏等[36]通过12 500 r/min高速搅拌提取桃仁粉末中4种AF类真菌毒素，并通过玻璃纤维滤纸滤过。魏俊德等[37]也用同样的方法对白苏子进行搅拌提取，测得4种黄曲霉毒素。王珂等[38]使用84%乙腈对薏苡仁中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素等7种真菌毒素高速搅拌提取。2005年，郑荣等[39]已使用70%甲醇加入氯化钠高速搅拌提取丹参、大枣、苦杏仁等中药中4种AF类真菌毒素。2010年，[40]他们对酸枣仁中的4种AF类真菌用同样的方法进行测定。杨文武等[41]也使用和郑荣相同的提取方法对白芍、陈皮、酸枣仁等中药中的4种AF类真菌毒素进行提取。刘书宇等[42]粉碎莲子后加入氯化钠，用80%甲醇高速搅拌提取并加入PBS稀释得AF类4种真菌毒素。赵淑锐等[43]使用80%甲醇水和正己烷加入人参粉末中高速搅拌后通过分层中性滤纸过滤，得续滤液加入磷酸缓冲盐和吐温-20得到黄曲霉毒素提取液。Yue Y T等[44]加入5 g聚乙二醇于薏苡仁、西洋参等中药材中再加入100 mL蒸馏水搅拌提取DON。

1.2 净化方法

样品净化是真菌毒素分析中的重要步骤，净化是指在不损失或尽可能少损失待测毒素的前提下，除去干扰杂质的过程。由于中药样品基质种类复杂及真菌毒素微量存在，样品的净化处理是测定真菌毒素的难点所在。目前常用的净化方法主要为免疫亲和柱净化法、固相萃取柱净化法及QuEChERS法。

1.2.1 特异性净化方法 免疫亲和层析(Immune Affinity Column，IAC)法基于抗原抗体反应，抗体连接在免疫亲和柱内，样品中的黄曲霉毒素经提取过滤、稀释，滤液缓慢经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱层析净化，黄曲霉毒素交联在层析递质中的抗体上。这种净化方法特异性强，回收率高，操作简便，选择性强，但价格昂贵。2015版药典规定对黄曲霉毒素的净化采用此方法[4]。朱迪等[22，26，31，41，43]通过玻璃纤维滤纸滤过的提取液均通过免疫亲和柱净化，首先用水洗涤杂质后甲醇洗脱真菌毒素，测定回收率均在75%～90%之间。郑荣等[35,37]对丹参、大枣、苦杏仁、白苏子等中药的提取液通过免疫亲和柱净化，回收率在60%～110%之间。郝爱鱼等[29]将120批中药澄清的溶液直接使用免疫亲和柱净化，回收率为95%～110%。Katerere D R等[7]使用不同的免疫亲和柱净化AFB1、和FB1、FB2。他将滤过0.45 um的滤液通过Aflatest column免疫亲和柱净化AB1、Strong Anionic Exchange Columns净化FB1、FB2、FB3。Ali N等[18]将助溶过滤后得到的澄清液通过免疫亲和柱净化后得到真菌提取液，通过HPLC柱后衍生测定AFB1、AFB2、AFG2 3种真菌毒素。YangYing等[34]得到供试液后直接通过免疫亲和柱净化，测定了AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA 5种真菌毒素。孔祥虹等[14]将提取液加入净化装置中的玻璃针筒中，使滤液以一定速率流入免疫亲和柱，分别用10 mL 0.1%吐温-20缓冲液、10 mL水淋洗后用1.0 mL甲醇洗脱、收集洗脱液，洗脱液经0.22 μm微孔滤膜过滤后得待测试液。赵淑锐等[43]将得到的提取液上A flaCLEANTM柱，直接用甲醇洗脱进行净化。韦日伟等[33]将过玻璃纤维的滤液通过AflaOchra免疫亲和柱净化，流速为2～3 mL/min，直至液体完全通过免疫亲和柱。再分别用10 mL真菌毒素清洗缓冲液和10 mL 水淋洗免疫亲和柱，最后用2 mL甲醇洗脱得黄曲霉毒素与赭曲霉毒素A。Zhang L等[11，46]等将0.45 um过滤的滤液直接通过免疫亲和柱净化，测得AFB1、B2、G1、G2 4种黄曲霉素，回收率均在80%～95%之间。曹纪亮等[31]对下文提到的不同种类的固相萃取柱进行了考察，包括Waters Oasis HLB柱、Agilent SampliQ C18柱、TC-M160 PuriToxSR多功能净化柱以及VicamAflaTest黄曲霉毒素免疫亲和柱，结果发现，前3种方法对鸦胆子的净化效果均不理想，检测时色谱图中杂质峰较多，对黄曲霉毒素的检测干扰严重，而免疫亲和柱对黄曲霉毒素有很好的选择性，能较好的去除基质中的干扰成分，适用于鸦胆子中黄曲霉毒素检测的样品净化要求，并测定4种黄曲霉毒素和一种赭曲霉毒素。付成平等[19]将直接离心得的上清液通过免疫亲和柱，以20 mL 0.1%吐温-20/PBS溶液分2次洗柱(流速为1～2 mL/min)，再以20 mL重蒸水分2次洗柱，弃去全部流出液，并使2～3 mL空气通过柱体,最后以1.0 mL色谱级甲醇洗脱,流速为1～2 mL/min。胡一晨等[25]比较了硅胶、中性氧化铝、硅藻土自制固相萃取柱和免疫亲和柱对黄曲霉毒素的净化效果，通过HPLC-ESI-Q-TOF-MS测定并选择免疫亲和柱净作为净化方式。Wei R等[33]考察Aflaochra HPLC柱和免疫亲和柱的净化效果，并对比了直接用20 mL水冲洗，10 mL水淋洗后磷酸缓冲液冲洗和10 mL水淋洗后吐温20冲洗对AFB1、B2、G1、G2、OTA回收率的影响，发现只有用免疫亲和柱中第3种冲洗方式较好。Yue Y T等[44]比较了硅酸镁载体、Mycosep225、Bond ElutMycotoxin、DON免疫亲和柱对DON的净化效果，发现除了免疫亲和柱其他的萃取柱净化后检测对DON影响较大。Kong W J等[27]考察了Agilent SampliQ C18-SPE柱、Romer Mycosep226柱、Sepax universal柱、WatersHLB柱、Bond ElutMycotoxin-SPE柱、MF160柱、AflaZearalTestTM免疫亲和柱和自制硅胶柱对薏苡仁中AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、β-ZOL、α-ZOL、ZON的净化效果，发现只有免疫亲和柱可以达到要求回收率。

1.2.2 非特异性净化方法

1.2.2.1 固相萃取柱净化法 固相萃取柱(Solid Phase Extraction，SPE)净化法利用了选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。较常用的方法是使液体样品溶液通过吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。SPE分为正相、反相、混合型色谱柱。下文提到C-18柱、Mycosep226柱等为反相色谱柱，硅胶、氧化铝柱为正相色谱柱，还有混合填料色谱柱等。这种方法缺乏专一性，净化痕量黄曲霉不够充分。陈重均[20]比较了Waters 226柱和HLB柱对不同真菌毒素的回收率，发现Waters 226对OTA、MPA回收率极差，故选择Waters 226为黄芪真菌毒素的净化方式。李俊媛[47]对安捷伦，Varian公司的Bond ElutMycotoxin-SPE柱、MF 160和CleanertPestiCarb-SPE小柱5种己商品化的固相萃取小柱，按相关文献中的制备方法处理样品,经HPLC-FLD检测,考察净化效果，发现前3种小柱处理后的供试品杂质峰多，影响目标物的检出，无法达到理想的净化效果，对于薏苡仁样品不适用；后2种小柱的净化效果较好。MF160小柱是Mycosep226柱的改进型，净化效果较好，没有杂质影响ZON、α-ZOL、β-ZOL的检测，但其价格较贵，与免疫亲和柱同价，故其选择CleanertPestiCarb-SPE对真菌毒素进行优化，虽对β-ZOL净化有影响，但对ZON、α-ZOL无影响，且价格便宜。林方芬等[16]比较了SPE柱、HLB、免疫亲和柱和石墨吸附柱对4种黄曲霉的净化能力后，选择了石墨吸附柱作为净化方式，通过检测得4种AF类真菌毒素的回收率在74.0%～102.7%之间。曹纪亮等[33]通过检测发现赭曲霉毒素对中药污染较为严重，所以对赭曲霉建立了新的净化方法，取AFFINIMIP SPE Ochratoxin A柱，依次用5 mL乙腈和5 mL纯水活化，将供试液上柱后用5 mL乙腈-0.1M HC1(40/60，v/v)淋洗柱子，最后用2 mL乙酸-甲醇(2/98,v/v)洗脱得赭曲霉毒素。Han Z等[9]考察了硅胶、硅酸镁载体、硅藻土3种吸附剂各自及混合对DON、3-ADON、15-ADON、NIV和Fus X的净化效果，发现3种混合对这5种真菌毒素的净化效果较好，选择用3种混合自制固相萃取柱作为其净化方式。Liu X等[10]比较了MultiSep 211 Fum柱和Oasis HLB SPE柱对FB1、FB2、FB3净化后的回收率，选择MultiSep 211 Fum柱为其净化方式。韩铮等[6]用硅胶、氧化铝、硅藻土、弗罗里硅土等常用的正相净化填料研制了一种新型复合萃取柱，将其应用到不同种类的中药材基质(如种子果实类、花类、根茎类和叶全草类)中。王珂等[38]比较了QuECHERS方法、C18小柱净化法和多功能净化柱(Mycosep 226)对7种真菌毒素的净化，选择Mycosep 226作为最终净化方式，得到的回收率在70%～120%之间。

1.2.2.2 QuEChERS法 QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法原理与高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)和固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。主要用于真菌毒素，农残检测等痕量检测中。QuEChERS方法回收率较高，精确度和准确度高，可分析的真菌范围广，分析速度快溶剂使用量少，污染小，价格低廉且不使用含氯化物溶剂，操作简便，且装置简单，但其去除杂质的效果较差，需要进一步优化。步骤可以简单归纳为：1)样品粉碎；2)单一溶剂乙腈提取分离；3)加入MgSO4等盐类除水；4)上清液进行GC-MS、LC-MS检测。Arroyo-Manzanares N等[12]将水飞蓟研磨，加入磷酸缓冲盐、5%甲酸乙腈涡旋后分别加入4 g硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸三钠，0.5 g柠檬酸二钠提取AF类、NIV、DON、FB1、FB2、OTA、T-2、HT-2、STE、CIT和ZEN等真菌毒素。李春等[35]先将何首乌粉末中加入水、1%乙酸乙腈溶液涡旋后再加入4种固体试剂，超声，选用液质联用MRM检测到AF类4种，OT类2种、FB类2种、DON、HT-2、T-2等12种真菌毒素。可见这种方法为提取与净化同时进行，节省时间。

2 小结

通过上述对提取方法的综述，发现大多数研究者提取真菌毒素选择60%～90%的甲醇水或乙腈水，但由于FB极性较大，OTA极性较小，有研究选择50%甲醇水或乙腈水提取FB，乙酸乙酯提取OTA。由于中药基质和真菌毒素本身结构的复杂性，为了提高真菌毒素的提取率，还可选择加入氯化钠等固体试剂、调节溶液酸碱性、加入吐温试剂助溶等不同的处理方法。当然，除了考虑如何选择提取溶剂外，提取方法对不同中药基质真菌度素的提取也有影响，如Zhao S等[45]将中药按其富含基质分类为脂肪油、挥发油、蛋白质和生物碱，并比较了超声、振荡、均质3种提取方法对不同基质中药的提取率，发现富含脂肪油的中药适合均质提取，富含挥发油和蛋白质的重要适合超声提取，富含生物碱的重要适合振荡提取。

中药真菌毒素的净化方法主要为免疫亲和柱法、固相萃取柱法及QuEChERS法，其中免疫亲和柱法特异性强，净化效果好，应用最为广泛，但其价格昂贵。故固相萃取柱和QuEChERS净化方法是目前研究者选择较多的方法，并且对这2种方法不断优化以使其对真菌的净化效果达到要求。除了以上3种净化方法外，基质固相分散、分子印迹固相萃取等净化方法已经应用到食品真菌毒素净化中[5]但还未应用到中药材的净化中。因此，中药真菌毒素的净化处理还需进一步分析研究，并且将食品真菌毒素中已有的前处理充分的引入到中药中来，并建设中药特有的处理方法。

3 讨论

我国传统中药在一定程度上受到了不同真菌毒素的污染，这些污染直接影响到人类健康。为了控制和监测真菌毒素的污染，真菌毒素前处理技术需要不断提高。中药基质的复杂性对真菌毒素的前处理影响很大，故针对不同基质中药真菌毒素提出不同的前处理方法极为重要。现已有有研究表明[6,20]，不同的中药材基质对真菌毒素的干扰强度不同，其中花类中药的基质效应小，而根茎类的基质效应较大。但如今大部分文献中，大批的中药材使用同样的方法同时提取多种真菌毒素检测，而只有极少文献对中药按基质不同进行分类，并且按基质效应的不同选择合适的提取方法。已有研究中已经证明不同浓度的甲醇对花类、种子类、全草类等不同基质中药的提取效果不同[45]，发现不同基质的中药所需要的最佳提取溶剂浓度是不同的，且不同的提取方法也对不同基质的中药材的真菌毒素有一定影响。因此在以后的研究中，需对中药按不同基质分类进行不同方法的提取方法进行设计。同样，不同的净化方法对不同基质的中药真菌毒素净化效果也是不同的，如韩铮等[6]运用自制净化柱对不同基质的中药真菌毒素净化，发现虽然净化柱对花类、种子果实类等都有净化效果，但都不及对根茎类的净化效果好。因此，在研究中还需对不同基质的中药选择不同的净化柱，以保证净化效果。