五灵脂炮制前后指纹图谱及含量测定比较

陈 莹 聂 晶 龙小艳 向 阳 黄志军

(1 武汉理工大学,武汉,430070； 2 健民药业集团股份有限公司,武汉,430052； 3 湖北省药品监督检验研究院,武汉,430075)

五灵脂为鼯鼠科动物复齿鼯鼠(TrogopterusxanthipesMilne-Edwards)的干燥粪便[1]，咸、甘、温，归肝经，具有活血、散瘀、止痛功效，主要用于治疗痛经、血瘀经闭、胃溃疡、蛇虫咬伤等症状。五灵脂主要含有氮类、三萜类、黄酮类、有机酸类、木质素类等成分[2]。五灵脂多为人工饲养鼯鼠收集粪便而得，陕西省商洛地区复齿鼯鼠养殖已成规模[3]。五灵脂的炮制方法包括4种：醋制、炒制、制炭、酒制，以醋制居多，2015年《中华人民共和国药典》收载的以醋五灵脂投药有7味[1]，以小金胶囊、小金丸、小金片等为主。五灵脂醋制能矫臭矫味，引药入肝，增加活血止痛功能[4]。闵凡印以浸出物和尿素含量为指标研究五灵脂炮制方法发现，醋拌匀闷一定时间0.5 h再炒至微干的方法，去除原药异味，药材外观等方面均优一于其他方法[5]。吴用琼和李江东对传统醋炙、酒炙五灵脂炮制方法进行改进，研制出醋酒炙法，以降低不良反应，去除五灵脂的腥臊臭味[6-7]。

刘文粢对比五灵脂及其炮制品微量元素含量进行比较，发现炮制后五灵脂可降低原药材中铝的含量而减少毒性[8]，但未对不同炮制品的HPLC指纹图谱进行比较。本实验采用HPLC法对五灵脂生品及其炮制品进行研究，建立五灵脂生品及其炮制品指纹图谱，并对五灵脂中穗花杉杉双黄酮及扁柏双黄酮进行含量测定，用以比较五灵脂生品及炮制品，阐明炮制对五灵脂化学成分的影响，为小金胶囊等中含醋五灵脂的制剂化学成分研究做铺垫。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DIONEX U3000液相色谱仪(美国戴安)，超声波仪(LC-350 A型，济宁中区鲁超仪器公司)，电子分析天平(XS 204型、XP204型，梅特勒-托利多仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)，密封型手提式粉碎机(CLF-40型，浙江温岭市创力药用植物器械厂)，Millipore超纯水机。

1.2 试药 穗花杉双黄酮对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111902-201102)、扁柏双黄酮对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：B-051-B-16026)、黄酒(北京二商王致和食品有限公司，批号：20180114)、米醋(山西来福老陈醋股份有限公司，批号：20180209)、乙腈为色谱纯(默克股份两合公司)、甲酸为质谱级，水为Millipore超纯水、其他均为分析纯。

1.3 分析样品

1.3.1 五灵脂生品 17批五灵脂药材均来自于陕西商洛养殖基地，经肖凌副主任药师鉴定为鼯鼠科动物复齿鼯鼠(TrogopterusxanthipesMilne-Edwards)的干燥粪便，药材来源及批次见表1。

1.3.2 五灵脂炮制品 取前10批生品五灵脂进行炮制，具体炮制方法如下：醋五灵脂：醋拌匀闷一定时间(约0.5 h后)再炒至微干，每100 kg五灵脂，用醋15 kg[5]，对应醋五灵脂编号为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10。

酒五灵脂：同醋五灵脂，对应酒五灵脂编号为J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9、J10。

清炒五灵脂：取五灵脂用文火炒至焦斑，或微黑色，放冷即可，对应炒五灵脂编号为Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9、Q10。

炭制五灵脂：取净五灵脂置锅内用中火炒至黑色存性为度，取出，放凉即可，对应炭五灵脂编号为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10。

表1 五灵脂批次

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent extend-C18(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.1%甲酸(B)为流动相梯度洗脱，0～15 min，15%～24%A,15～20 min，24%～45%A，20～40 min，45%～50%A，40～50 min，50%～90%A，50～55 min，90%～15%A，55～60 min，15%A；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长335 nm；进样10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮各约5 mg，穗花杉双黄酮加甲醇溶解并定容至10 mL，制成每1 mL含0.479 9 mg穗花杉双黄酮储备液，扁柏双黄酮加1 mL二甲基亚砜先溶解再加甲醇定容至10 mL，制成每1 mL含0.5060 mg扁柏双黄酮储备液。

2.3 供试品溶液制备 取五灵脂样品粉末(过3号筛)约1 g，精密称定，分别置圆底烧瓶中，加90%甲醇50 mL，称重，回流提取30 min，放冷，再称定重量，用90%甲醇溶液补足减失重量，滤过，滤液经微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4 五灵脂不同炮制品指纹图谱建立

2.4.1 精密度试验 取同一批号五灵脂生品及炮制品，按“2.2.2”方法制备供试品，照“2.1”色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果表明，以5号峰为参照峰，9个共有峰(如图1)的相对保留时间RSD均小于0.05%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批号五灵脂生品及炮制品，按“2.3”方法制备供试品，照“2.1”色谱条件进样分析，在0、6、12、24、36、48 h测定，记录色谱图。结果表明，以5号峰为参照峰，48 h内6次进样所得图谱的9个共有峰的相对保留时间RSD均小于0.14%，相对峰面积RSD均小于3.78%，表明供试品溶液在48 h内较稳定。

2.5 重复性试验 取同一批号五灵脂生品及炮制品各6份，按“2.3”方法制备供试品，照“2.1”色谱条件进样分析，记录色谱图。结果表明，以5号峰为参照峰，9个共有峰的相对保留时间RSD均小于0.05%，相对峰面积RSD均小于3.4%，表明重复性良好。

2.6 五灵脂不同炮制品指纹图谱建立及相似度评价 将17批五灵脂生品及40批不同炮制品的色谱图批样导入《中药色谱指纹图谱相似度评价体系》2012版软件进行相似度评价，以批号170713的生品或炮制品五灵脂为参照图谱，采用中位数对照图谱生成法，时间窗口宽度为0.5 min，经多点校正后自动匹配显示五灵脂生品、醋五灵脂、酒五灵脂、炒五灵脂均检出9个主要色谱峰，炭炒五灵脂显示11个主要色谱峰，在保留时间13.35 min、24.89 min处新增T1，T2 2个峰，2、3、4、5峰的峰面积显著降低，其中5，8号峰分别为穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮。见图1、图2。由软件可以计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱的相似性系数，生品五灵脂相似度在0.959～0.999之间。醋五灵脂相似度在0.963～0.999之间，酒五灵脂相似度在0.977～0.999，炒五灵脂相似度在0.966～0.999，炭五灵脂相似度在0.967～0.997，表明每种炮制品检出成分较为稳定，差别较小。

2.7 五灵脂不同炮制品中穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮含量测定

2.7.1 线性关系考察 取上述同等量穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮储备液分别100 μL、100 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1 mL，加甲醇稀释定容至100 mL、50 mL、25 mL、25 mL、25 mL，摇匀，各精密吸取10 μL，按上述色谱条件测定。以进样量(X：ng)和峰积分面积(Y：微伏*s)进行线性回归，得穗花杉双黄酮回归方程Y=0.0138X+0.0036,R=0.999 2；扁柏双黄酮回归方程Y=0.0134X+0.0046，R=0.999 5，结果表明，穗花杉双黄酮进样量在4.799 ng～479.9 ng的范围内线性关系良好，扁柏双黄酮进样量在5.060～506.0 ng的范围内线性关系良好。

2.7.2 重复性试验 取同一批五灵脂粉末6份，按“2.3”制备供试品溶液，记录峰面积，计算含量，结果表明该方法重复性良好，穗花杉双黄酮RSD为1.73%，扁柏双黄酮RSD为1.16%。

2.7.3 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别于0、6、12、24、36、48 h进样10 μL，测定峰面积，计算含量，穗花杉双黄酮RSD为2.23%，扁柏双黄酮RSD为0.90%。

2.7.4 准确度试验 取已知含量的五灵脂粉末6份，约0.5 g，精密称定，精密加入穗花杉双黄酮对照品储备液0.5 mL、扁柏双黄酮对照品储备液0.5 mL，按供试品制备方法制备样品，测定峰面积，计算回收率。穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮回收率分别为92.92%、103.26%，RSD值分别为1.24%、1.89%。

2.7.5 样品含量测定 取所有样品，按照“2.3”条方法制备供试溶液，在“2.1”色谱条件下进行分析，记录峰面积，采用外标法计算穗花杉双黄酮(SHS)和扁柏双黄酮(BB)含量。结果见表2，S、C、J、Q、T代表不同炮制方法；1、2、3、4、5等代表样品编号。生品五灵脂穗花杉双黄酮含量范围0.0266%～0.0516%，扁柏双黄酮含量范围0.0443%～0.0804%；醋制品五灵脂穗花杉双黄酮含量范围0.0238%～0.0529%，扁柏双黄酮含量范围0.0353%～0.0718%；酒制品穗花杉双黄酮含量范围0.0247%～0.0512%，扁柏双黄酮含量范围0.0363%～0.0744%%；清炒五灵脂穗花杉双黄酮含量范围0.0230%～0.0494%，扁柏双黄酮含量范围0.0358%～0.0702%，炭炒五灵脂穗花杉双黄酮含量范围0.0109%～0.0269%，扁柏双黄酮含量范围0.0158%～0.0481%。由含量结果表明，炭制对五灵脂中穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮含量影响最为明显，表现显著降低；而其他炮制方法对穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮含量影响不明显。

图1 五灵脂生品

注：(A)醋五灵脂(B)酒五灵脂(C)清炒五灵脂(D)炭炒五灵脂(E)指纹图谱共有模式

表2 五灵脂中穗花杉杉双黄酮和扁柏双黄酮百分含量测定结果(%)

图2 不同炮制品HPLC指纹图谱

注：5：穗花杉双黄酮、8：扁柏双黄酮、S：生五灵脂HPLC指纹图共有模式、C：醋五灵脂、J：五灵脂、Q：清炒五灵脂、T：炭炒五灵脂

3 讨论

3.1 提取条件的考察 实验比较了超声和回流2种提取方式发现回流提取效率高；回流提取时间考察了30 min、1 h、2 h、3 h，结果表明，回流30 min后指标性成分无明显增加；比较乙酸乙酯、乙醇、甲醇、90%甲醇、80%甲醇等提取溶剂，结果90%甲醇提取穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮效率最高，提取溶剂用量选择发现50 mL 90%甲醇提取较完全，故确定最佳提取条件为50 mL 90%甲醇回流提取30 min。

3.2 指纹图谱分析 实验发现醋制、酒制、清炒五灵脂与生品五灵脂HPLC指纹图谱相差不大，但通过气味发现，醋制、酒制后减少了五灵脂腥臊恶臭味，说明醋制、酒制、清炒对五灵脂的紫外吸收成分无明显影响，但对挥发性成分影响较大，有待进一步分析不同炮制品挥发性成分。炭炒五灵脂与生品五灵脂HPLC指纹图谱差别较大，且有紫外吸收的成分含量明显减少，可能与炮制温度和时间有关，炭制温度较高，且时间较长，导致化学成分发生变性，含量降低。

图3 侧柏叶

注：(A)五灵脂、(B)色谱图

3.3 食物相关性 将五灵脂色谱图与侧柏叶色谱图比较发现，如图3所示，五灵脂9个共有峰均来自于侧柏叶，为原形代谢产物，以穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮含量最高，据报道穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮有很强生物活性，有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤作用[9]，可能为五灵脂的活血成分之一。实验发现批号为170713和160325的五灵脂较其他批号五灵脂前3个峰较为明显。见图1中A图S1、S13。与复齿鼯鼠的饲料侧柏叶色谱图比较发现,这3个峰按色谱图出峰顺序分别为杨梅苷、槲皮苷、山奈素-3-鼠李糖[10]，表明此批号对应复齿鼯鼠的吸收能力较其他批号差，具体对五灵脂活血活性影响有待考察。通过色谱图比较可以大致区别侧柏叶和五灵脂，侧柏叶以2号峰(槲皮苷)为主，而五灵脂以5号(穗花杉双黄酮)，8号(扁柏双黄酮)峰为主，此方法可用于控制侧柏叶加泥土的掺伪。