复方丹参注射液对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠CYLD/NF-κB信号的影响*

马 丹 包先丽 叶 霜 陶 然

（1.北京市和平里医院，北京 100013；2.北京安贞医院，北京 100029）

重症急性胰腺炎（SAP）属于临床常见急性腹部病症之一，不仅造成胰腺炎症损伤，还会累及重要器官受损，其中急性肺损伤（ALI）在SAP早期最为常见，是导致SAP患者死亡的重要原因［1］，因此探究SAP-ALI发病机制，对于预防以及治疗SAP-ALI，改善患者预后均十分重要。研究显示核因子-κB（NF-κB）参与ALI的发生，抑制NF-κB通路后可减轻ALI炎症损伤［2］。 圆柱瘤蛋白（CYLD）为 NF-κB 负调节因子，有学者研究显示CYLD在ALI过程中发挥负调控作用［3］。以上研究表明CYLD/NF-κB可能作为SAPALI治疗靶点。本研究旨在探究复方丹参注射液对SAP-ALI大鼠的保护作用，以及在CYLD/NF-κB通路的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF清洁级雄性SD大鼠购自中国中医科学院中药研究所，体质量 260 g，8～10周龄，合格证号：SYXK（京）2016-0013。

1.2 试药与仪器

复方丹参注射液，四川升和药业股份有限公司，批号：20161016；地塞米松注射液，广西万德药业股份有限公司，批号：20160918；苏木素、伊红染液购自美国Sigma公司；BCA蛋白测定试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司；山羊血清、5%脱脂牛奶购自美国Gibco公司；兔抗鼠 CYLD、p65、p-p65、IκBα、p-IκBα 抗体均购自美国 Sigma-Aldrich 公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自美国Rche公司。低温离心机购于Eppendorf公司；倒置显微镜、凝胶成像系统购自日本Olympus公司。

1.3 模型制备

根据文献法［4］制备SAP-ALI大鼠，制备前大鼠自由饮水，禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，随后固定于手术台，常规消毒、铺巾后，于腹正中做一切口，暴露十二指肠，并将其提出体外，识别胰胆管汇入十二指肠系膜乳头开口处，在其下缘肠壁处选取无血管区，用注射器针头穿刺后，将5 cm硬膜外导管置入，朝向开口方向缓慢推进5 cm后，缝扎胰胆管下段以及硬膜外导管，于导管末端连接输液转换器，泵入5%0.1 mL/kg牛黄胆酸钠，流速控制在0.2 mL/min，2 min后见胰胆管以及主胰管扩张后，维持10 min，将缝扎线去除，并将导管退出，封闭穿刺孔，复位十二指肠后逐层关腹。假手术组仅翻动十二指肠、胰腺，不穿刺注药。造模后48 h内观察到大鼠进食减少、饮水增多、毛色灰暗、背部弓起、耳缘静脉突起加粗，并伴有眼球变浊暗淡等症状，同时肺部听诊可闻杂音，且呼吸急促，则判定造模成功。共60只大鼠造模成功。

1.4 分组及给药

造模后，将模型制备成功的大鼠随机分为模型组、SM低、中、高剂量组、地塞米松组，每组12只。造模后6 h后开始给药，复方丹参注射液（SM）低、中、高剂量组：经尾静脉注射 3、6、12 mL/kg，每日 1 次，连续给药7 d。地塞米松组：经尾静脉注射地塞米松2 mg/kg，每日1次，连续给药7 d。模型组：将等剂量生理盐水以相同的方法进行尾静脉注射，每日1次，连续注射7 d。

1.5 标本采集与检测

末次给药后6 h，大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，处死后，抽取腹水，采集腹动脉血3 mL，获取左肺进行支气管肺泡灌洗（BAL）；同时获得右肺上叶组织，置于PBS溶液中洗涤后置于4%多聚甲醛中固定；取右肺中叶以评估肺湿/干质量比；迅速切除胰腺、右肺下叶组织，冻存于-80℃，进行后续蛋白免疫印迹分析等。

1.5.1 胰腺、肺组织病理学检查 将右肺上叶组织置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋制备5 μm切片。脱蜡、脱水后，进行苏木精-伊红（HE）染色后，于显微镜下进行组织病理学检查。收集图像后参考Schmidt病理评分法［5］，对胰腺组织进行评分。0分表示无明显病理学变化，1分表示水肿局限或弥漫性叶间隙扩张、2～10个小叶或血管周围出现炎性细胞浸润；2分表示水肿扩张至小叶间，11～20个小叶或血管周围出现炎性细胞浸润；3分表示水肿呈弥漫性间隙扩张，21～30个小叶或血管周围出现炎性细胞浸润；4分表示水肿呈弥漫性间隙扩张，超过30个小叶或血管周围出现炎性细胞浸润。采用Holfbauer评分法［6］对肺组织病理情况进行评分，主要从水肿、出血、炎症浸润等进行评定：肺部无病变为0分；25%视野出现以上病变为1分，50%视野出现病变为2分，75%视野存在以上病变为3分；整个视野均出现以上病变为4分。

1.5.2 腹水量、肺组织干湿比重测定 处死大鼠后，抽取腹水，观察颜色，并对体积进行测定；取胰腺、右下叶肺组织置于电子天平中称重，此时所测质量为湿重，置于80℃恒温箱内烘烤，直至质量不再发生变化，此时所测重量为干重，计算干湿重比值（W/D）。

1.5.3 动脉血气指标测定 采用全自动血气分析检测仪检测腹动脉血中氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2），计算氧合指数（OI）。

1.5.4 蛋白免疫印迹法检测CYLD/NF-κB信号通路蛋白检测 取出保存肺组织，添加RIPA裂解缓冲液，提取总蛋白。BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳结束后，转移至PDVF膜上。置于4℃下加入一抗孵育过夜。洗涤后加入二抗常温孵育3 h。采用化学发光试剂显影后，使用Quantity One软件分析相对蛋白表达水平。

1.5.5 免疫组化检测CYLD/NF-κB信号通路蛋白表达 常规制备肺组织石蜡切片（4 μm），脱蜡脱水后置于柠檬酸钠中孵育20 min，添加3%过氧化氢中孵育10 min，10%山羊血清孵育30 min。加入一抗后置于4℃孵育过夜。将PBS孵育的切片作为阴性对照，添加二抗孵育30 min，随后添加链霉亲和素过氧化物酶孵育15 min。然后用PBS洗涤后添加DAB溶液，显微镜下观察显色后水洗，添加苏木精进行复染，氨水返蓝后用自来水冲洗，添加二甲苯透明处理，并用中性树脂封片，显微镜下进行观察肺组织形态结构变化，标尺为100 μm。

1.5.6 大鼠BAL中性粒细胞（PMN）计数 将收集的BAL置于4℃、3000 r/min离心10 min后，保存上清液。利用血细胞自动分析仪对BAL中PMN进行计数。

1.5.7 BAL 中 TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、SOD、MDA 含量测定 收集 BAL， 参照 TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒说明书进行操作；采用硫代巴比妥酸法测定MDA水平；亚硝酸盐法测定SOD水平。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组胰腺、肺组织病理性形态学观察

HE染色显示假手术组胰腺组织细胞正常，间质未出现炎性细胞浸润、充血以及坏死组织；模型组胰腺腺泡细胞出现大量坏死，结构模糊、融合至一片，小叶结构模糊，出现大量炎症细胞浸润，间隔明显变宽；见图1。SM组、地塞米松组均得到明显改善，且随着处理计量的增加，组织逐渐恢复正常。假手术组肺泡结构完整，肺间质未出现水肿、炎性细胞浸润等；模型组肺泡壁变厚、间隔变宽，肺间质充血伴随炎性细胞浸润，SM组、地塞米松组均得到明显改善，且随着处理计量的增加，组织逐渐恢复正常。见图2。

图1 各组胰腺组织病理学检查（HE染色，100倍）

图2 各组肺组织病理学检查（HE染色，200倍）

与假手术组相比，模型组大鼠胰腺、肺组织病理评分升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，SM组、地塞米松组胰腺、肺组织病理评分均降低，随着给药剂量的升高，胰腺、肺组织病理评分逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

表1 各组大鼠胰腺组织、肺组织病理评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠胰腺组织、肺组织病理评分比较（分，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同

组 别 n 肺组织病理评分 胰腺组织病理评分假手术组 1 2 0.3 2±0.0 5 0.2 9±0.0 6模型组 1 2 3.8 1±0.6 4* 7.4 3±1.0 5*S M低剂量组 1 2 2.9 5±0.5 2△ 6.2 2±0.8 4△S M中剂量组 1 2 2.3 4±0.6 1△ 4.5 1±0.5 7△S M高剂量组 1 2 1.0 6±0.2 8△ 2.2 7±0.2 9△地塞米松组 1 2 0.7 4±0.1 7△ 1.7 8±0.3 6△

2.2 各组大鼠腹水量、W/D、PMN比较

见表2。与假手术组比较，模型组腹水量、胰腺、肺组织W/D均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，地塞米松组、SM各组腹水量、胰腺、肺组织W/D降低，具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组腹水量、W/D、PMN水平比较（±s）

表2 各组腹水量、W/D、PMN水平比较（±s）

组 别 n 腹水量（m L）胰腺（W/D） 肺组织（W/D）假手术组 1 2 0.6 8±0.1 2模型组 1 2 1 0.3 5±2.3 8*4.3 2±0.3 8 4.5 2±0.3 8 7.4 6±0.6 9* 6.4 2±0.3 9*S M低剂量组 1 2 9.1 7±1.0 8△S M中剂量组 1 2 7.5 4±0.6 1△6.3 8±0.4 5△ 5.6 3±0.4 1△5.3 9±0.3△ 5.0 7±0.3 2△S M高剂量组 1 2 6.1 7±0.8 7△4.1 5±0.2 9△ 4.6 8±0.3 7△地塞米松组 1 2 5.2 6±0.7 4△3.8 6±0.4 2△ 4.1 6±0.3 9△

2.3 各组动脉血气相关指标比较

见表3。与假手术组比较，模型组PaCO2升高，PaO2、OI降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，地塞米松组、SM各组PaCO2降低，PaO2、OI升高，具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠 PaCO2、PaO2、OI水平比较（mmHg，±s）

表3 各组大鼠 PaCO2、PaO2、OI水平比较（mmHg，±s）

组别 n P a O 2 P a C O 2 O I假手术组 1 2 9 5.7 2±2.5 8模型组 1 2 5 3.0 6±3.5 3*3 2.2 9±1.8 8 4 4 9.3 6±7.1 8 5 7.5 7±2.6 1* 2 9 2.7 6±8.4 6*S M低剂量组 1 2 6 4.2 2±2.5 9△S M中剂量组 1 2 7 8.1 4±2.2 6△4 6.8 7±2.3 9△ 3 2 5.3 9±6.5 7△3 8.1 3±2.2 4△ 3 7 7.1 2±7.5 6△S M高剂量组 1 2 8 5.1 7±2.4 4△3 1.5 8±1.8 7△ 3 8 9.6 3±8.0 3△地塞米松组 1 2 8 7.6 6±1.5 1△3 0.7 3±1.6 4△ 3 5 7.2 3±9.1 8△

2.4 各组大鼠肺组织CYLD、NF-κB通路蛋白检测比较

见图3、表4。与假手术组比较，模型组p-p65、p-IκBα蛋白表达升高，CYLD蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，地塞米松组、SM各组p-p65、p-IκBα蛋白表达降低，CYLD蛋白表达升高，具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组间p65、IκBα蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组CYLD、NF-κB通路蛋白表达

表4 各组大鼠肺组织 p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、CYLD通路蛋白比较（±s）

表4 各组大鼠肺组织 p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、CYLD通路蛋白比较（±s）

组 别 n假手术组 1 2模型组 1 2 S M低剂量组 1 2 p-I κ B α C Y L D 0.1 2±0.0 3 1.0 5±0.1 9 0.7 2±0.0 8* 0.3 6±0.0 8*0.5 5±0.0 9△ 0.4 5±0.0 6△S M 中剂量组 1 2 0.7 2±0.1 2 0.6 4±0.0 8△ 0.7 3±0.1 2 0.4 2±0.0 7△ 0.5 8±0.1 1△S M 高剂量组 1 2 0.7 4±0.1 5 0.5 2±0.0 7△ 0.7 5±0.1 1 0.3 1±0.0 5△ 0.7 1±0.1 4△地塞米松组 1 2 0.7 1±0.7 0.4 3±0.0 8△ 0.7 6±0.1 2 0.2 5±0.0 4△ 0.9 7±0.1 2△p 6 5 p-p 6 5 I κ B α 0.6 7±0.0 9 0.1 5±0.0 3 0.7 6±0.0 6 0.6 9±0.1 1 1.0 8±0.1 5* 0.7 2±0.0 9 0.7 1±0.1 4 0.8 9±0.1 1△ 0.7 4±0.1 8

2.5 大鼠肺组织CYLD、NF-κB通路蛋白阳性表达率检测比较

见图4～图6、表5。与假手术组比较，模型组pp65、p-IκBα蛋白阳性表达率升高，CYLD蛋白阳性表达率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，地塞米松组、SM各组p-p65、p-IκBα蛋白阳性表达率降低，CYLD蛋白阳性表达率升高，具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 各组p-p65在肺组织中的表达（免疫组化染色，400倍）

图5 各组p-IκBα在肺组织中的表达（免疫组化染色，400倍）

图6 各组CYLD在肺组织中的表达（免疫组化染色，400倍）

表5 各组p-p65、p-IκBα、CYLD 蛋白阳性表达率比较（%，±s）

表5 各组p-p65、p-IκBα、CYLD 蛋白阳性表达率比较（%，±s）

组别 n p-p 6 5 p-I κ B α C Y L D假手术组 1 2 1 1.3 5±1.4 1模型组 1 2 4 2.8 6±5.4 7*2 2.6 8±1.5 6 3 9.7 2±1.2 6 4 6.3 5±3.7 8* 1 2.1 6±1.3 4*S M低剂量组 1 2 3 2.3 1±3.8 2△S M中剂量组 1 2 2 6.0 5±4.7 3△3 4.5 6±3.5 1△ 1 9.3 7±2.3 8△2 3.3 5±3.0 1△ 2 7.9 7±1.5 9△S M高剂量组 1 2 2 0.2 7±2.1 8△1 5.6 2±2.3 9△ 2 1.2 7±1.9 2△地塞米松组 1 2 1 9.4 5±2.3 2△1 4.3 6±2.3 4△ 2 0.6 4±1.1 5△

2.6 各组大鼠肺组织中 TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、SOD、MDA水平比较

见表6。与假手术组比较，模型组PMN、TNF-ɑ、IL-1β、IL-6、MDA水平升高，SOD水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，地塞米松组、SM各组 PMN、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平降低，SOD水平升高，具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

本研究通过逆行胰胆管穿刺法制备SAP-ALI模型，结果显示胰腺、肺组织病理评分、腹水量、胰腺、肺组织 W/D、PaCO2均升高，PaO2、OI降低，HE 染色显示胰腺腺泡细胞大量坏死，出现大量炎症细胞浸润；肺泡壁变厚、间隔变宽，肺间质充血伴随炎性细胞浸润。表明模型大鼠胰腺、肺组织均出现严重炎症性损伤和组织病理改变，提示动物模型制备成功。因此，改善SAPALI关键在于控制肺组织炎症反应。

表6 各组大鼠肺组织中 PMN、TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、MDA 水平测定比较（±s）

表6 各组大鼠肺组织中 PMN、TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、MDA 水平测定比较（±s）

组 别 n假手术组 1 2模型组 1 2 S M低剂量组 1 2 I L-1 β（n g/m L）0.2 4±0.0 3 0.7 1±0.0 6*0.5 3±0.0 6△S M 中剂量组 1 2 1.5 6±0.2 4△ 1.3 0±0.1 9△ 0.6 9±0.0 8△ 0.4 1±0.0 7△S M 高剂量组 1 2 1.0 3±0.2 3△ 1.1 5±0.1 7△ 0.5 3±0.0 9△ 0.3 2±0.0 5△地塞米松组 1 2 0.7 9±0.1 4△ 1.0 9±0.0 8△ 0.4 6±0.0 5△ 0.2 7±0.0 3△P M N（×1 0 7/L）T N F-α（n g/m L）I L-6（n g/m L）0.7 5±0.1 3 0.8 8±0.1 3 0.3 6±0.0 4 2.9 2±0.3 5* 1.8 3±0.4 5* 0.9 8±0.1 1*2.1 4±0.2 8△ 1.4 2±0.3 3△ 0.8 4±0.1 2△S O D（n g/m L）M D A（n g/m L）1 7.8 8±4.2 6 7.8 6±1.3 9 8.5 3±0.6 1* 3 3.8 7±2.1 7*9.4 9±1.5 3△ 2 1.2 9±3.4 6△1 1.7 9±2.8 2△ 1 6.4 9±2.3 2△1 3.7 8±2.6 6△ 1 2.3 2±2.2 9△1 3.9 6±2.1 8△ 1 0.6 5±1.9 8△

丹参为复方丹参注射液的主要成分，临床药理试验均证实丹参具有抗血栓、抗氧化、抗心肌缺血、调节血脂的功效，一般用于冠心病、心肌梗死、脑缺血等心脑血管疾病［7-8］。近期研究显示其也可用于在肺部病变治疗，陈杰文等研究显示丹参可通过抗氧化作用改善微循环，降低血清中炎症因子浓度，进而缓解肺损伤［9］。杜识博等研究显示，丹参可通过降低CRP等炎性物质的产生，减轻患者局部炎症损伤，改善肺功能［10］。以上临床研究均提示丹参对ALI具有一定的保护作用。但有关丹参在SAP-ALI的作用机制目前尚不清楚。本研究结果显示给予复方丹参液治疗后SAP-ALI大鼠胰腺、肺组织损伤有所改善，腹水量、胰腺、肺组织W/D、PaCO2均降低，PaO2、OI升高，提示复方丹参注射液对SAP-ALI肺组织损伤具有改善作用，但其作用机制尚不明确。

研究显示NF-κB信号通路激活在ALI中占有重要地位，抑制该通路的活化可能为治疗ALI的靶点［11］。NF-κB一般情况下被IκBα抑制，以非活性状态存在于细胞质中，在外界刺激下IκB发生磷酸化被激活，NF-κB抑制作用被解除，磷酸化后进入细胞核内，促进靶基因的转录［12-13］。苏中昊等研究显示内毒素致ALI大鼠NF-κB激活后可导致肺组织损伤，而经宣白承气汤治疗后可明显缓解肺损伤［14］。冯洋等研究显示阻断NF-κB 信号通路激活后，可预防 ALI的发生、发展［15］。本研究结果显示模型组大鼠p-p65、p-IκBα蛋白表达升高，说明NF-κB通路被激活，给予复方丹参注射液后，大鼠p-p65、p-IκBα蛋白表达明显降低，表明复方丹参注射液可能通过抑制NF-κB信号通路活性，缓解肺部炎症损伤。CYLD为肿瘤抑制蛋白，研究显示CYLD蛋白功能缺失后会导致NF-κB信号通路过度激活，进而导致各种炎症的发生［16］。CYLD能够将泛素化底物中的多聚泛素链解除，因此其可抑制-IκBα激酶复合物，进而抑制NF-κB信号通路激活，为该信号通路的负调控因子［17］。近期研究显示抑制CYLD后可引发SAP-ALI，进而引发炎症反应［18］。本研究显示模型组大鼠蛋白表达降低，给予复方丹参注射液后，CYLD蛋白明显升高，提示复方丹参注射液可能通过激活CYLD蛋白活性，抑制NF-κB信号通路，缓解肺部炎症损伤。

PMN浸润与肺组织炎症性损伤密切有关，抑制PMN可显著降低动物模型中的肺损伤严重程度［19］。肺泡巨噬细胞是肺组织中先天性免疫细胞，可产生过量的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性细胞因子，引发炎症反应［20］。SOD属于机体内重要的抗氧化酶，主要作用为清除体内多余的自由基，MDA反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出组织损伤的程度［21］。本研究发现，模型组BAL中PMN数量显著升高，且肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平显著增加，SOD 水平明显降低，进一步证实SAP-ALI大鼠肺组织炎性损伤。经复方丹参注射液治疗后，BAL中炎症细胞因子水平、MDA均显著降低，SOD水平显著升高，提示复方丹参注射液可能通过减少肺组织中炎症细胞因子，抑制肺组织中性粒细胞浸润，缓解氧化应激作用，从而减轻肺组织炎症反应，缓解肺组织损伤。

综上所述，复方丹参注射液能够缓解SAP-ALI肺部炎症损伤，同时激活CYLD蛋白表达，抑制NF-κB号通路活性，推测复方丹参注射液改善SAP-ALI肺损伤可能与激活CYLD蛋白、抑制NF-κB信号通路有关。但SAP-ALI肺损伤机制较复杂，本研究中复方丹参注射液仅能部分缓解肺组织炎症反应，而非逆转SAP-ALI引发肺损伤，这可能还与其他因素有关，需要深入探究，以期为疾病的治疗提供更有力依据。